检测小鼠肝脏的caspase活性[创新技巧]

细胞发生凋亡时，除了形态学变化以外，还会发生一系列生化事件。其中，caspase酶的依次激活是凋亡重要的生化改变。Proemga公司的Caspase-Glo®检测试剂盒是一种检测caspase活力的均质发光检测方法。本文节选了Promega公司的用户使用Caspase-Glo®试剂盒而发表的论文，供更多的研究者参考。

细胞发生凋亡时，除了形态学变化以外，还会发生一系列生化事件。其中，caspase酶的依次激活是凋亡重要的生化改变。Proemga公司的Caspase-Glo® Assays(a,b) (以下称Caspase-Glo®检测试剂盒)是一种检测caspase活力的均质发光检测方法。试剂盒中提供了一种氨基萤光素发光前体底物(含蛋白酶识别序列)和专利的耐热萤光素酶，试剂已经经过优化。加入Caspase-Glo® 试剂会导致细胞裂解, 随后caspase将底物裂解。释放出的游离氨基萤光素被Ultra-GloTM 重组萤光素酶作用后产生一种"辉光型"的发光信号。该信号的强弱与caspase 的活性成正比。稳定的萤光素酶和专利的缓冲液使得该试剂盒在不同的实验条件下都可发挥很好的性能。不同于荧光或比色分析法，该发光分析法不易被其他化合物的干扰而影响。Caspase-Glo® 3/7,8和9试剂盒可以用多孔板模式，既可用于纯化的酶测定，也可直接在培养的细胞中应用。Caspase-Glo® 2和6试剂盒用于纯酶制备。
   
我们在此节选了Promega公司的用户使用Caspase-Glo®试剂盒而发表的论文（Liu, D. et al. (2004) Nuclear import of proinflammatory transcription factors is required for massive liver apoptosis induced by bacterial lipopolysaccharide. J. Biol. Chem. 279, 48434–42），供更多的研究者参考。节选原文发表于Promega公司的技术刊物Cell Notes 第11期。

-- 普洛麦格（北京）生物技术有限公司

本研究观察了cSN50肽在小鼠肝细胞凋亡中的作用。cSN50肽是应激反应转录因子（stress-responsive transcription factors ，SRTFs）的核内转移抑制剂。使用脂多糖（LPS）和2-氨基-2-脱氧-D-半乳糖（D-Gal）攻击造成急性肝损伤的小鼠动物模型，实验组于造模前后使用cSN50 肽进行处理，对照组仅用溶剂做相应处理，结果显示实验组小鼠的肝细胞凋亡程度低于对照组。本工作检测了LPS /D-Gal 处理的小鼠肝组织匀浆中的起始caspase酶（caspase-8、caspase-9）和效应caspase酶（caspase-3/7）的活性。

用caspase-Glo® 3/7、-8和-9试剂盒检测小鼠肝组织匀浆中caspase-3/7、8和9的活性

雌性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS和D-Gal。然后将小鼠分成两组。在使用脂多糖和D-Gal攻击前后，实验组小鼠接受腹腔注射cSN50肽，共7次。对照组小鼠腹腔注射物为5% DMSO（溶剂对照）。

为检测小鼠肝脏caspase-3/7，-8和-9活性，作者使用了Caspase-Glo®-3/7，-8和-9检测试剂盒(a,b)(Cat.#分别是G8090, G8200和G8210) ，仅对操作步骤做了轻微修改。被修改的步骤为：在制备Dounce肝组织匀浆过程中，使用了低渗提取缓冲液（25mM HEPES [pH7.5]，5mM MgCl2，1mM EGTA，1mM Pefabloc®和胃酶抑素、亮肽素和抑酞酶各1μg/ml)。匀浆后，4°C 13000 rpm 离心15分钟，澄清提取液。将澄清的提取液中的蛋白质浓度预先调整为1mg/ml，–80°C下冻存。为测定caspase活性，作者将稀释后的提取液 (10μg/ml)与Caspase-Glo®检测试剂等体积混合，置于96孔白壁培养板中。室温孵育1小时，之后使用读板的发光检测仪读数。 

caspase-3/7的检测数据表明，C57BL/6小鼠先单独使用溶剂（5%DMSO；无肽抑制剂）处理，然后再用LPS和D-Gal攻击，使用Caspase-Glo○R3/7检测试剂盒检测，结果显示肝组织中被激活的caspase-3和caspase-7的水平增加。LPS和D-Gal攻击后6小时，细胞中的caspase-3/7活性达到最大值（图1）。最有趣的是，小鼠经cSN50肽处理，其肝细胞的凋亡程度低于溶剂对照组。

图1. 对照组和cSN50肽处理组小鼠启动caspase酶和效应caspase酶激活的时间依赖性。根据Liu, D等2004年描述的实验方案，野生型C57BL6小鼠腹腔注射LPS和D-Gal前后，用cSN50肽 (0.7mg，溶于200μl 5% DMSO)或溶剂进行处理。LPS和D-Gal攻击后检测了溶剂对照组（空白柱）和cSN50肽处理组（实心柱）肝脏caspase酶的活性。误差线表示每个数据点四只小鼠均值的±标准差。P值表示对照组和cSN50肽处理组之间相对光单位-RLU的差异显著性(双向ANOVA分析)。图片的引用得到了以下授权：Dr. Jacek Hawiger, Vanderbilt University, 及The Journal of Biological Chemistry。

通过研究启动caspase酶-caspase-9（内源性途径）的活性和caspase-8（外源性途径）的活性，作者还分析了诱导凋亡的内源性和外源性途径。在LPS和D-Gal攻击后的不同时间点（0-6小时），分别检测肝组织提取物中两种caspase酶的活性。没有接受cSN50肽的对照组小鼠，在接受LPS和D-Gal治疗后6小时，caspase-8和caspase-9两种酶的活性都显著提高。在经过cSN50肽处理的小鼠组，caspase-8和-9的活性与caspase-3/7一样，均有降低。作者指出，虽然在LPS/D-Gal治疗后的1小时内炎症细胞因子TNF-α水平增加，但是肝组织的caspase-8活性直到治疗后的6小时都不会增加。

根据肝组织caspase酶活性的数据和其它相关支持数据，作者推断SRTFs的核内转移对于凋亡的启动和由于巨噬细胞释放细胞因子而引起的肝损伤（图2）具有非常重要的意义。最终，这一发现将有助于理解由巨噬细胞表达的炎症细胞因子介导的大面积肝组织凋亡的生物学及其发病机理。

图2.细胞因子/趋化因子激活、以及在此LPS诱导的肝损伤模型中，以肝组织酶的释放、肝细胞凋亡和死亡表示的肝脏损伤的时间进程示意图。异常指数表示所研究的参数的增加倍数。图片的引用得到了以下授权：Dr. Jacek Hawiger,Vanderbilt University, 以及The Journal of Biological Chemistry.

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