邵峰博士继Science文章后再发PNAS

　　

生物通报道：来自北京生命科学研究院的消息，北京生命科学研究院的研究人员报道了许多病原细菌通过其三型分泌系统向宿主细胞注入一类全新的类巯基蛋白酶的效应分子进而引起宿主细胞周期的阻断。这一研究成果公布在《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上。

领导这一研究的是邵峰博士，其实验室主要研究兴趣是研究细菌病原体和宿主细胞相互作用过程中的生物化学机制，这一研究成果得到了科技部863和北京市科委资助课题，之前邵峰研究小组曾在《Science》杂志上报道，志贺氏菌属（shigella）的III型受体OspF能够抑制丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen-activated protein kinase phosphatase，MAKP)家族成员MAKP-1和MAKP-2，以及c-Jun N-terminal 激酶和p38。

文章的第一作者分别是技术员姚庆和研究生崔霁欣为，其他参与此项工作的还有，朱永群博士，汪国轮（技术员），胡丽燕（技术员），刘新奇博士，柳丽萍（技术员），曹冉和黄牛博士以及蛋白质组中心的龙承祖和陈涉也参与了部分研究工作。

通过三型分泌系统分泌毒力效应蛋白分子进入真核宿主体内，进而阻断或调节宿主免疫相关的信号通路是许多革蓝氏阴性病原菌普遍采用的致病机制，也是目前研究较为广泛的领域。但近年来的研究显示，除免疫信号通路之外，对真核细胞周期的干扰也可能是病原细菌在感染和致病过程中采取的一个重要策略。目前这方面深入的机理研究还鲜有报道。

在这项工作之前，法国的一个研究小组用遗传筛选的方法发现了某些肠道大肠杆菌能通过其三型分泌系统分泌一个能引起宿主细胞周期阻断的效应分子。邵峰小组在这篇文章中首先发现类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)、昆虫病原线虫共生菌（Photorhabdus luminescens）以及某些肠道耶尔氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的基因组都编码了序列上有一定程度相似的基因，并证明了这些基因编码的蛋白都确实能引起真核细胞周期阻断在G2/M。通过对类鼻疽杆菌的效应分子（命名为CHBP）的结构分析，作者发现，尽管和木瓜蛋白酶（Papain）家族不存在蛋白一级序列上的同源性，这类效应蛋白却具有和木瓜蛋白酶相似的折叠模式。更为重要的是，木瓜蛋白酶家族保守的催化位点三联体（Cys-His-Asp/Asn）在CHBP的相应结构区域，以及整个CHBP家族的效应分子中都保守。定点突变研究发现，无论是在细菌感染，还是将纯化的重组蛋白直接导入到真核宿主细胞中，构成催化位点三联体的氨基酸对引起细胞周期阻断的表型似乎都是绝对必不可少的。通过生物化学和质谱的实验发现，CHBP及其同源效应分子的用于催化的巯基能够被一种叫做E-64的、已知能够特异性修饰木瓜蛋白酶催化三联体中半胱氨酸的小分子抑制剂所共价修饰。但和木瓜蛋白酶家族一般利用所谓S2位点来识别并决定底物切割位点的性质不一样的是，CHBP的S2位点没有显著的结构特征，而其S1/S1’位点却有一个非常特征性的带负电荷的口袋结构。该位点的突变能使CHBP家族的效应分子彻底丧失阻断细胞周期的功能。作者进一步通过分子模拟和对接的研究发现，这个带负电荷的口袋可以非常理想地结合一个精氨酸，而精氨酸也似乎是20个氨基酸中唯一适合结合该口袋结构的氨基酸。这个结果说明，CHBP家族的效应分子极有可能需要识别其靶点蛋白中一个精氨酸来行使其功能。

这篇文章不仅揭示了一类全新的存在于多种致病菌中、且具有很强的阻断细胞周期活性的三型分泌系统效应分子，而且发现这类病原效应分子是通过和木瓜蛋白酶类似的催化活性来实现对细胞周期的阻断，为后续进一步寻找其宿主靶点蛋白和彻底阐明作用机理的研究提供了很好的线索和依据。由于这类效应分子引起的细胞周期阻断（G2/M）并不涉及已知的DNA损伤途经，这项研究也将很有可能丰富和加深人们对真核细胞周期本身的理解。有趣的是，邵峰博士在早年对耶尔氏菌三型分泌系统效应分子的功能研究中，首次发现耶尔氏菌的YopT分子和植物假单胞菌的AvrPphB定义了一类广泛存在于多种细菌病原体中新的、和木瓜蛋白酶类似的巯基蛋白酶家族（Cell, 2002, v109, p575; Science, 2003, v301, p1230; Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, v101, p302）。本文报道的结果（以及近几年国际上其他几个实验室的研究发现）也延续和进一步验证了病原细菌通过具有巯基蛋白酶活性的毒力效应因子来感染和致病是一个较为普遍的机制的观点。

附：

邵峰博士
北京生命科学研究所研究员
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研究概述：

本实验室研究兴趣主要在于研究细菌病原体和宿主细胞相互作用过程中的生物化学机制，研究目标是希望能够发现病原体在抑制真核宿主细胞免疫信号系统中一些新的作用方式，以帮助我们理解相关病原菌的致病机理。实验室的一个研究方向是研究志贺氏痢疾杆菌是如何通过分泌各种效应分子进入真核宿主体内进而干扰宿主的免疫防御机制。从研究志贺氏痢疾杆菌致病的分子机制出发，实验室在最近的研究中发现并定义了一类广泛存在于多种细菌病原体(包括志贺氏痢疾杆菌)中新的磷酸化苏氨酸裂解酶。这种酶能够特异识别并不可逆地“去磷酸化”宿主的MAPK激酶。这种全新的酶学活性和共价修饰使得这些病原菌在感染后能够迅速和有效地抑制真核宿主的MAPK激酶介导的免疫信号通路。目前，实验室也在集中研究其它几个志贺氏痢疾杆菌效应分子的生化和生物学功能。实验室希望通过结合多种生物化学和细胞生物学的手段来研究并阐明这些效应分子是如何协同作用以及它们在志贺氏痢疾杆菌感染和致病过程中所扮演的角色。同时，本实验室对蛋白质泛素化及泛素降解通路在细胞周期，细胞增殖以及肿瘤形成过程的作用感兴趣。最近的研究结果表明一类含有BTB结构域的蛋白可能作为一种由CUL3组装的新的泛素E3连接酶复合物的特异性连接分子。目前的研究工作集中在验证这些新的BTB蛋白能够通过CUL3依赖性的泛素化通路调节细胞周期和细胞增殖并阐明其机制。后续的工作将进一步研究这些新的蛋白降解通路在某些肿瘤细胞增殖中所起的作用。

原文摘要：

A bacterial type III effector family uses the papain-like hydrolytic activity to arrest the host cell cycle

Pathogenic bacteria deliver effector proteins into host cells through the type III secretion apparatus to modulate the host function. We identify a family of proteins, homologous to the type III effector Cif from enteropathogenic Escherichia coli, in pathogens including Yersinia, Photorhabdus, and Burkholderia that contain functional type III secretion systems. Like Cif, this family of proteins is capable of arresting the host cell cycle at G2/M. Structure of one of the family members, Cif homolog in Burkholderia pseudomallei (CHBP), reveals a papain-like fold and a conserved Cys-His-Gln catalytic triad despite the lack of primary sequence identity. For CHBP and Cif, only the putative catalytic Cys is susceptible to covalent modification by E-64, a specific inhibitor of papain-like cysteine proteases. Unlike papain-like enzymes where the S2 site is the major determinant of cleavage-site specificity, CHBP has a characteristic negatively charged pocket occupying surface areas corresponding to the S1/S1′ site in papain-like proteases. The negative charge is provided by a conserved aspartate, and the pocket best fits an arginine, as revealed by molecular docking analysis. Mutation analysis establishes the essential role of the catalytic triad and the negatively charged pocket in inducing cell cycle arrest in host cells. Our results demonstrate that bacterial pathogens have evolved a unique papain-like hydrolytic activity to block the normal host cell cycle progression.