在合适的时间点检测凋亡（上）[创新技巧]

凋亡是指与细胞死亡相关的一系列的特定的细胞形态学变化。Promega的专家们列出了一些影响因素，这些因素可能会对凋亡相关的生物化学事件产生的时间产生影响，并着重阐述在某适合的时间区段内监测这些生化事件的重要性。

作者：TERRI SUNDQUIST, M.S., RICH MORAVEC, B.S., ANDREW NILES, M.S., MARTHA O’BRIEN, PH.D., AND TERRY RISS, PH.D., PROMEGA CORPORATION

凋亡是指与细胞死亡相关的一系列的特定的细胞形态学变化。我们列出了一些影响因素，这些因素可能会对凋亡相关的生物化学事件产生的时间产生影响，并着重阐述在某适合的时间区段内监测这些生化事件的重要性。

引言
细胞死亡会发生一系列的作用通路不同的细胞形态学和生物化学变化，包括凋亡、坏死和自我吞噬(1)。“凋亡”这一名词最先由Kerr等人（2）创建，用来描述具有确定的形态学变化的细胞死亡，包括细胞皱缩、染色质浓集、核膜的完整性消失、胞膜空泡化（plasma membrane blebbing）、最后形成凋亡小体。虽然凋亡指的是纯粹的形态学变化，但是在这些形态学变化中常伴随着生物化学反应的发生。这些生化反应包括启始Caspase酶和效应Caspase酶的激活、线粒体细胞色素C的释放、质膜磷脂酰丝氨酸的外化，多聚[ADP-核糖]聚合酶（PARP）的降解和核DNA的断裂。

这些生物化学事件并不都是凋亡所特有的，不会在所有的凋亡细胞或凋亡的所有阶段都发生，也不会在所有凋亡诱导剂刺激时都发生。这些生化事件发生的时程也有很大差别，并受许多因素的影响，包括细胞系或组织、凋亡诱导剂、药物浓度或刺激强度和暴露时间。因此，有策略地选择检测哪些生化事件就变得十分关键，通过检测这些生化事件可以证实细胞的死亡是由于凋亡引起的，同时，还可以了解细胞死亡的动态过程。本文中我们主要讨论了在适宜的时间段内检测这些生化事件的重要性，确保这些变化被捕捉到，而不致错过。我们也列出了一些可能会影响相关生化事件的检测时限的因素。

细胞凋亡过程中的生化事件的时限
通常，细胞凋亡是通过外部的或内部固有的途径而进行的。外部（受体介导的）途径涉及受体结合、激活起始caspase酶 （ caspase-8）、caspase-8继而激活caspase-3或者切割Bcl-2家族成员Bid，从而放大caspase-3的激活效应；Bid的切割导致细胞色素C漏出、蛋白复合体（也称作凋亡复合体）的形成，以及caspase-9的激活（3）。内部固有（线粒体介导的）途径涉及某些Bcl-2家族成员，这些成员可以调节细胞色素C从线粒体中的释放。细胞色素C一旦从线粒体中释放出来，就会与Apaf-1、dATP和caspase-9前体形成凋亡复合体。作为凋亡复合体的一部分，caspase-9经过某种处理而被激活，激活的caspase-9继而激活caspase-3。在这两种途径中，晚期凋亡事件在效应caspase酶被激活后发生，包括质膜外表面磷脂酰丝氨酸的暴露（可通过锚定蛋白V的结合而被检测到）、多聚[ADP-核糖]聚合酶（PARP）的降解和核DNA断裂。

生物化学事件发生的精确时间取决于凋亡途径。另外，凋亡被诱导后，检测不同的生化事件或活性的时间点往往也是不同的。例如，使用抗Fas单克隆抗体（mAb）处理Jurkat细胞，凋亡的外部通路即被激活，Fas受体形成三聚体，引发构象变化，促使死亡诱导信号复合体（DISC）形成。使用抗Fas单克隆抗体处理Jurkat细胞后，caspase-8活性在处理后3小时就达到峰值，而caspase-3/7活性在测量的7小时内逐渐增加（图1）。PARP在处理后6小时达到降解高峰，而晚期事件-DNA断裂，直到处理后9小时仍没有达到峰值（图2）。在最佳测量时间段之前或之后对这些事件进行检测，都可能导致测量的信号与背景（比较1小时和7小时时溶剂对照组和抗Fas单克隆抗体处理组的caspase-8活性，图1）相比太弱或没有，从而导致结论错误，认为该处理方式不会诱导细胞凋亡。因此，根据经验确定在什么时候目标活性出现峰值是非常关键的。所以，研究者应进行预实验来确定某一检测的最佳时间，或实验时，确保在足够长的一段时间内进行检测，并设立多个间隔适当的检测时间点，以捕捉到活性峰值。

图1. caspase-8和caspase-3/7活性的时间依赖性。按25000个细胞/孔的密度接种Jurkat细胞，每小时加入抗Fas单克隆抗体或溶剂，共7小时。使用 Caspase-Glo® 8发光试剂盒检测caspase-8活性，底物为Z-LETD 氨基萤光素。使用改进的荧光Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7试剂盒检测caspase-3/7的活性，底物为 (Z-DEVD)2-R110。室温孵育1小时后，记录同一孔的发光值和荧光值(4)。

图2. TUNEL和PARP降解的时间过程。按照图示的时间用抗-Fas单克隆抗体处理Jurkat细胞。使用DeadEnd™ Fluorometric TUNEL系统（Cat.#G3250）和抗PARP p85片断的pAb(Cat.#：G7341)PARP，对细胞进行双标记，前者可评估DNA片段化的程度，后者用于特异性识别被切割的PARP。每一横排表示在图示时间点的同一区域的细胞。每一纵列表示不同的染色方法。在每一个时间点，DAPI染色显示每一区域中细胞核的数量。标尺=20μm。

许多因素都可能对凋亡事件的时限产生影响，包括所用的细胞系或组织、凋亡诱导剂、药物浓度或刺激强度、暴露时间等。在此，我们对这些因素中的一些进行讨论，并指出在适宜的时间段检测这些生化反应事件的重要性。

细胞系或组织的影响
在完全相同的条件下，不同的细胞系或组织的反应可能会有很大差异。同一种诱导剂在一种细胞系中可能会诱导凋亡，而在另一种细胞系中则不能诱导出凋亡。在某些情况下，某一处理方式所导致的结果相同（细胞死亡），但是作用机制完全不同。使用相似浓度的阿霉素处理HL60和K562细胞，HL60细胞会出现凋亡形态学变化和DNA laddering，而K562细胞则出现坏死性的形态学变化，并且不会出现DNA片断化（5）。

即便是使用完全相同的凋亡诱导剂，不同的细胞发生凋亡的时间进程也会不同。在一种细胞系中活性达到峰值所需要的时间可能会不同于另外一种细胞系。例如，十字孢碱处理细胞后，DNA出现片断化。在EL4细胞中（6），这种DNA片断化在处理后5-6小时达到峰值，而在HCE细胞（7）中则在处理后24小时才达到峰值。因此当您查阅出版文献中的凋亡诱导条件时，请不要假定该诱导条件对您的细胞系的影响与对其它细胞系的影响相同。

一般来讲，诱导培养细胞表现出凋亡事件的特征所需要的时间（几小时内；5-10）要早于组织中的细胞（几天内；11-14）。当对体内模型进行研究时，可能永远检测不到某些晚期凋亡事件，因为在这些事件被检测到之前，组织内发生凋亡的细胞常常已经被吞噬掉了。

在一些情况下，由于被观察的组织或细胞系未表达某一必需蛋白，则某些凋亡相关的生化事件可能会被“低估”了。乳腺癌细胞系MCF-7 缺少功能性caspase-3蛋白，所以当使用DEVD底物来检测caspase-3/7活性时，凋亡情况可能会被低估。与此类似，一种细胞如果不能表达某一必需受体，就不能通过外部通路诱导其凋亡。一个经典的例子就是使用抗Fas单克隆抗体诱导带有Fas受体的Jukat细胞，通过外部通路诱导凋亡。缺少Fas受体的细胞不会对抗Fas单克隆抗体的处理发生反应，细胞就不会发生凋亡。

因为细胞周期各阶段存在不均一性和差异，同一细胞群中的不同细胞可能会在不同的时间点经历凋亡事件。例如，HeLa细胞经紫外线照射时，一些细胞可能会出现凋亡晚期事件，如细胞膜破裂，而同一群中的其它细胞可能正经历细胞色素C从线粒体内释放这一相对早期的凋亡事件（10）。紫外线照射后检测早期凋亡信号的时间点和多种凋亡事件之间检测的时间间隔都不是固定不变的。在本例中，细胞色素Ｃ从某一单个细胞中释放只发生在5分钟的时间内，而整个细胞群释放细胞色素C却在数小时的时间内均能检测到。这样，细胞群的不均一性就降低了在某一较窄时间段内检测感兴趣的生化事件的要求。然而，为了得到一个时间上比较精确的事件，还是要对单个细胞进行分析（10，15）。

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（未完，待续）

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