质谱成像新技术大解密

　　

生物通报道： 现代生物学研究已经不再停留在仅从组织中识别一种特殊的化学成分，或者蛋白成分上了，我们需要精确的了解这些物质是如何分布，如何构成的，解答这些问题需要更进一步的实验技术，比如免疫组化或免疫荧光检测方法，但是这些技术需要特殊的抗体，而且效率低，偏差大。

因此研究人员将目光转向了质谱技术上，以质谱为基础的成像方法不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，不需要对待测物进行标记，分析物可以其最初的形态被检测，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量，适用于研究生物分子的反应。

质谱成像（Imaging Mass Spectrometry,IMS）这种最新原位分析技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析分子在细胞或组织中的 “结构、空间与时间分布”信息。其基本流程（以质谱分析生物组织标记物为例）见下：

 
简单而言，质谱成像技术就是借助于质谱的方法，再配套上专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。但是随着这项技术的不断发展，也陆续出现了许多针对各种问题的新技术。

最早的质谱成像技术是基质辅助激光解吸电离（MALDI，matrix assisted laser desorption ionization）质谱分子成像技术，由范德堡大学（VanderbiltUniversity）的Richard Caprioli等在1997年提出，他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比（m/z）化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息，来进行生物标志物的发现和化合物的监控。

正如数字图像包括三个通道：红，绿，蓝一样（单个亮度定义了每个像素的颜色），质谱成像也包含了数以千计的通道，每一个对应于一个特殊的光谱峰值，“你可以通过质谱方法从这些像素中获得任何信号，然后调整图像中所需分子像素的相对亮度……最后得到一张分子特异性的成像图。”

这种方法可用于小分子代谢物，药物化合物，脂质和蛋白，而且质谱成像能相对快速的利用许多分子通道，完全无需特殊抗体。当然要了解组织的成分构成，并不只是有扫描组织这一种方法，具体要根据个人的硬件设备，分子特异性，以及分辨率来判断。在这里，生物通综合列出了五种先进的质谱成像方法，方便你初步了解质谱成像技术。

1.挑战高分子量蛋白——MALDI质谱分子成像技术

在对组织或生物体进行成像，分析小分子构成的时候，有一个“拦路虎”总是阻碍实验的进程，那就是多肽，这些多肽体积十分大，要想对它们进行分子成像几乎是不可能的，比如想要研究肿瘤边缘的分子微环境，如果直接成像是不可能获得清晰图像的。

来自范德堡大学的质谱方法专家Richard Caprioli博士因此发明了基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱分子成像技术，这项技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量。

研究人员将人类肾细胞透明细胞癌（clear cell carcinoma）样品放到MALDI靶板（Target plate）上，利用一个结晶体，有机基质物质，通过MALDI激光离散成像这一组织，阅读，移动平板后再重复。 利用这种方法，Caprioli研究组成功的在人类肾癌样品中发现了，一组只存在于肿瘤组织学边缘的蛋白，这为解释这些肿瘤为什么能够在手术之后，迅速复发提供了一个分子线索。

MALDI成像方法也许是最普通的一种MS成像方法，而且这也是唯一一种能对蛋白作图的方法，创始人Caprioli博士提出，MALDI的优势就在于这种方法能进行高分子量的分子分析，Caprioli博士就已经利用这种方法对300kD的蛋白进行了作图。

MAIDI成像技术相关的产品不少，但主要集中在几家厂商。比如Labcyte公司，赛默飞世尔科技公司，Bruker Daltonics公司，美国应用生物系统公司（ABI，现属于生命科技公司），以及岛津公司。

赛默飞世尔科技公司2008年推出的MALDI LTQ Orbitrap XL系列产品就将MALDI和LTQ Orbitrap相结合，在一台仪器汇聚了MALDI源和orbitrap质量分析器各自的优势，使其特别适合应用在蛋白质组学和代谢组学领域。

这台机器巧妙的在LTQ XL离子阱质谱中引入MALDI，能提供用于消解后的蛋白，多肽和翻译后修饰（PTMs）分析所必须的信息量丰富的质谱图，而且通过消除样品制备过程简化了完整组织, 生物样本和高聚物样本的分析过程。

MALDI LTQ Orbitrap XL系列产品在成像方面的优势主要在于，具有能进行差异分析的多个激光程序，扫描成像分辨率高。另外赛默飞世尔还推出了一款ImageQuest软件，帮助研究人员可以直接从组织样品采集数据并显示出MS图像。

MALDI LTQ Orbitrap可以支持：
高通量的分析二维凝胶胶内酶切样品，鉴定蛋白；
利用碰撞诱导裂解（CID），Q值脉冲裂解（PQD)，高能C阱裂解（HCD），产生的肽碎片信息作为肽段信息的补充；
从头测序，iTRAQTM定量，组织图像和小分子物质分析；
在MS，MS/MS和MSn数据中，轻易就可实现分辨率大于50,000 FWHM，质量准确度大于2ppm。

普渡大学就引进了这项技术，他们认为MALDI LTQ Orbitrap XL结合了MALDI源的稳定性和高通量的能力、LTQ的灵敏度以及Orbitrap的高准确度和分辨率等优点。MALDI LTQ Orbitrap XL非常适合表征蛋白质复合物。经过一级和二级质谱分析和鉴定后，样品可保留在MALDI靶上，根据第一次分析结果继续研究新的感兴趣的方面。

索要相关的技术资料>> >>

需要指出的是MALDI LTQ Orbitrap主要用于小分子成像，如果需要了解小分子如药物中的分布成像，可以考虑MALDITOF/TOF相关的产品。目前测定小分子的组织成像MALDI-FTMS是最佳选择，国外一些大的制药公司都在开展这方面的工作。

另外值得推荐的一种MAIDI成像技术经典产品来自LabCyte公司，目前MAIDI成像在样品组织表面点上MALDI溶液，再进行激光照射，产生该点的质谱，而LabCyte公司推出的Portrait 630反应物多斑可以用于MALDI组织成像的自动标记。

这一技术的关键点在于曾获得R&D年度创新大奖的Portrait 630 Reagent Multi-Spotter，这种全自动、非接触性、利用声波移液高级精密仪器，能高速的将MALDI matrix与其它试剂移至组织切片或样本上，这个速度可以达到每个spot点样时间不超过两分钟。并且准确与灵活的点对点定位与时间安排，使连续性化学反应得以进行，并促进晶体形成，得到高品质、高灵敏与高再现之质谱结果。

Multi-Spotter样品支架可搭载不同大小之质谱实验专用玻璃或金属片，四色CCD影像系统可撷取有染色或无染色之组织样本，使用者能准确的reagent点至正确的位置上，可控制每个spot的滴数、重複点样的次数、滴数与滴数、cycle与cycle间的时间等。

除此之外，布鲁克公司是最早提供完整的MALDI成像所需硬件和软件完整解决方案的，而且还有自我研发生产的ImagePrep基质自动喷雾仪，这种基质的自动程序化喷雾也是MALDI成像成功的关键之一。MALDI Imaging的鼻祖Richard Caprioli博士的实验室就拥有两台Bruker的MALDI-TOF，用于发现组织中的蛋白多肽生物标志物。

还有AB Sciex公司的5800 MALDI TOF-TOF和4800 Plus MALDI TOF-TOF质谱系统可以做到从组织表面直接获得高分辨的数据，在整个组织表面没有观察到质量漂移，而且表面电荷效应影响很小。MS/MS实验可以轻松覆盖0.1~100KDa质量范围的各类型分子。

2.无需样品处理 实时成像——电喷雾电离技术

一般质谱成像方法由于体积庞大，重量重，需要冗长的样品准备阶段，因此并不适用于即时成像（bedside applications），比如说要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控，那么就要寻找新的方法了。

一种称为电喷雾电离技术（desorption electrospray ionization，DESI）的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出，由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下，从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。

这种方法的原理是带电液滴蒸发，液滴变小，液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度，液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子。

（DESI动画，来自Prosolia Inc）

DESI与另外一种离子源：SIMS（二次离子质谱）有些相似，只是前者能在大气压下游离化（另外一种商业化的大气压游离化技术是JOEL公司的DART），发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法，即利用快速带电可溶微粒（比如水或者乙腈acetonitrile）进行离子化，然后冲击样品，获得分析物的方法。

这项技术的专利属于位于美国印第安纳州首府印第安纳波利斯的Prosolia Inc，这家公司积极开发了DESI相关的产品，比如omni spray DESI系列产品，被用于生物、药物分析、法医鉴定、环境分析、材料分析、安全防卫等多个领域。

其中一种便携式型号的物质摄谱仪只有8磅，采用非侵害方式进行检测，整个过程不到1秒钟，这种非侵害方式使其适用于医疗应用，如扫描疾病早期症状的生物标志，还可用于食品处理行业，在食品出厂前检查细菌污染。

DESI系列产品最大的优势就在于无需样品处理，一般质谱和高效液相色谱分析，样品必须经过特殊的分离流程才能够进行分析检测，使得一次样品检测常常需要约一个小时，而DESI系列产品可将固体样品直接送入质谱,溶液被喷射到检测表面,促使样品离子均匀分布。采用这一手段的质谱分离过程，只需3分钟左右即可完成。

正是由于这一杰出的表现，Prosolia公司的DESI系列产品已经被许多大型实验室购入，还有一些制药公司也表示了浓厚的兴趣，比如罗氏就希望能利用这一技术增加其抗流感药物Tamiflu的防伪鉴定。不过要拥有这种仪器技术不便宜，每台仪器大约耗资数十万美元，Prosolia公司表示未来可能会研制出更便宜，更便携的仪器。

3.活体成像——APIR MALDI/LAESI技术

了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键。但是直到目前为止，唯一的方法是观察单个细胞的内部，然后将其从动物或植物中移除，或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话，会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别，或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。

来自华盛顿大学Akos Vertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析，在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中，研究人员发现叶片中积累基质很厚，常导致光谱末端低分子量部分模糊，而且基质辅助激光解析电离（MALDI）质谱分析需要在真空中进行，但活体样本在真空中无法存活。

实际上，MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。而生物样品也可以直接吸收能量的，比如2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。

因此Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线（an atmospheric pressure infrared，APIR）MALDI激光直接激活组织中的水分，使样品气化，就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸，从而获得了离子化微粒，进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电，大部分其实是不带电的，会被APIR MALDI遗漏。

为了捕捉这些中性粒子，Vertes等人采用了第二种方法：LAESI (laser ablation electrospray ionization，激光烧蚀电喷雾电离，生物通译)，这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒，然后重新电离化。通过对整个样品进行处理，复合这两种方法，就能覆盖更多的分子，分析质量更高。

与一般质谱成像过程不同，Verte的方法还在成像中增加了高度，从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm，高度30mm，这与生物天然的立体像素相吻合，这样科学家们就可以获得天然构像。

要想进行APIR MALDI/LAESI分析，首先要拥有一台中红外激光器，X/Y/Z轴位传递架（x/y/z translation stage,生物通译），以及一台定制的LAESI光源。

其中中红外激光器可选择范围比较广，比较常见的是经典激光器厂商Opotek公司，这家公司是世界首家商用OPO激光器（可调谐激光器）的生成商，其IR-OPO-红外OPO激光器系统具有宽红外光谱覆盖：Mid-IR (2.6－3.45um)，是计算机控制的一体化OPO激光系统。价格大约在4－6万美元之间。另外X/Y/Z轴位传递架可以考虑Thor Labs和理波（Newport）公司的产品，前者能提供配套的激光器安装座和激光器驱动电源和温度控制器，可以根据激光器的工作电流和功率来选择激光器电流源和温度控制器。后者是著名的光学产品研发制造企业，在生物和生命科学，微电子等领域有着近40年的研发制造经验。

4.3D成像——二次离子质谱技术

质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合，直接分析生物组织切片，产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据，通过质谱数据分析处理软件自动标峰，并生成该切片的全部峰值列表文件，然后成像软件读取峰值列表文件，给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数，再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。

但是一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像，来自宾夕法尼亚州州立大学的Nicholas Winograd教授改进了一种称为二次离子质谱（SIMS，secondary ion mass spectrometry）的方法，可以对样品进行完整扫描，三维成像。

SIMS早在用于生物学研究之前就已经应用广泛了，比如分析集成电路（integrated circuits）中的化学成分，这种质谱技术是表面分析的有利工具，能检测出微小区域内的微量成分，具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量能力。

这种技术具有几个优点：速度快（－10,000 spectra per second），亚细胞构造分辨率（－100 nm），以及不需要基质。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一种“软”技术，这种方法只能对小分子成像，因此常常需要进行粉碎。

Winograd教授改进了这一方法，他利用了一种新型SIMS光束（carbon-60 磁性球），这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面，类似于“一阵爆炸”，这样重复的轰击使得研究人员能深入样品，进行三维分子成像，Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”（molecular depth profiling，生物通译）。

C60的能量与其它的离子束相当，却不到达样品表面以下，这样样品可以连续地被逐层剥离，研究人员就可以得到纵面图形，最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验，随着薄膜逐渐被C60剥蚀，可以获得糖和肽的稳态信号。最终，薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60 ，粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此这种方法具有良好的空间分辨率，能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。

这里还要说到一点，SIMS和上一技术（APIR MALDI/LAESI技术）都可以对三维成像，但两者也有差别，SIMS方法中，采用高能离子轰击样品，逐出分析物离子（二级离子），离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化，另外SIMS探针可以探测到100nm的深度，能提供纳米级的分辨率，而MALDI可以探测更深，但空间分辨率较低。

目前购买SIMS仪器耗费庞大，常需要百万美元的资金，研究人员可以选择一些实验室定制SIMS服务，比如上海交通大学分析测试中心。如果需要购买，常见的厂家有法国CAMECA公司，德国Ion Tof公司和英国Millbrook公司。

其中CAMECA公司的Nano SIMS50是一种全新的磁式双聚焦仪器，以探针扫描方式成像，特别适合于超精细微小区域的同位素 (或元素) 检测,它的特点包括：可以用很高的灵敏度和质量分辨率对小到 50nm 的微小区域进行成分分析 ；可以同时检测5个微量同位素 (元素)，在生物学 、纳米科技等方面获得应用。

而Ion Tof公司的TOF SIMS系列产品中，TOF SIMS IV是较为常用的一种，它成像的方式为扫描成像，在进行深度分析时同时需要两个离子枪，其中一个用来在纵方向溅射刻蚀样品， 另一个用来对新溅射出来的样品的坑底进行飞行时间质谱分析。这一仪器的特色为：质量范围宽( 1－10000amu) ；可以进行表面有机分析，静态SIMS分析；可以进行超薄薄层深度分析。

5.高灵敏度 高分辨率——纳米结构启动质谱技术

质谱在检测生物分子方面有很大潜力，但现有方法仍存在一些缺陷，灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说，需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物，较易错判，因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。

来自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱（nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS）的新技术，这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域，从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析，而且还能用于组织成像。

NIMS利用了一种特制的表面，这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物，这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发，这种爆发释放出离子化的分析物分子，它们被吸收到表面上，使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料，从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。

通过这种方法可以分析很多类型的小分子，比如脂质，糖类，以及类固醇，虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别，但是这是一种一步法的方法，比MALDI简单多了——后者需要固定组织，并添加基质。

由于含氟聚合物不能很好的离子化，因此会发生轻微的光谱干扰，而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI，所以NIMS产生的生物分子是整块离子化，而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高。

目前还没有NIMS成型的产品，如果要进行相关的实验，可以选择硅片（silicon wafers），以及定制荧光聚合物来DIY实验，相关花费大约是1500美元，之后每个芯片成本大约是6美元。

（感谢赛默飞世尔王博士，以及布鲁克公司张博士对本文的修改意见）
（生物通：张迪）