xCELLigence系统实时、免标记细胞浸润与迁移分析[创新技巧]

对于进行浸润与迁移分析的研究人员来说，使用罗氏应用科学部xCELLigence RTCA DP仪器，以及CIM-Plate 16，通过建立在阻抗基础上的技术方法，可对细胞反应进行实时监测，而不需要进行外源性标记处理。该系统也成功入围2009生命科学十大创新产品评选活动。

作者：Christopher Bird 与 Shelli Kirstein
美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏公司应用科学部罗氏诊断。通讯作者联系地址：S.K.（[e-mail]）。

本文译自2009年8月的《自然-方法学》

对于进行浸润与迁移分析的研究人员来说，使用罗氏应用科学部xCELLigence RTCA DP仪器，以及CIM-Plate 16，通过建立在阻抗基础上的技术方法，可对细胞反应进行实时监测，而不需要进行外源性标记处理。CIM-Plate 16 可对实验期间细胞反应情况进行动态监测，对细胞浸润与迁移的发生以及浸润及迁移率进行详细观测。这种监测信息可帮助研究人员理解细胞反应过程，对细胞反应过程进行如此精细的监测，是目前终点实验所无法做到的。

细胞浸润与迁移分析原理
对细胞浸润与迁移的研究，在更好地理解潜在的生物与分子机制方面，具有非常重要的价值。罗氏应用科学部最新的CIM-Plate 16产品，可对细胞浸润与迁移进行实时检测，而不需要进行额外的标记处理。

细胞浸润是指细胞尤其是癌细胞对周边组织的侵入与破坏。细胞迁移是指细胞由一个区域移动至另外一个区域，通常是对化学信号所做出的反应，在各种生理与病理过程中，包括胚胎发育、细胞分化、伤口愈合、免疫反应、炎症，尤其是癌症转移过程中，非常重要。

用于迁移检测的常规方法是建立在终点与标记基础上的实验方法。其中一种最常用的实验方法是Boyden chamber实验 （也被称为 trans-well 小室迁移检测实验），该实验中，细胞被放置于间隔上室中，细胞可通过一种人造微孔滤膜进行浸润与迁移，并可浸润或迁移至间隔下室中，间隔下室中含有一种化学趋化物质。

这种方法也有缺陷，必须使用化学染料对迁移的细胞（通常是滤膜反面的细胞）进行染色处理，或使用荧光分子对迁移细胞进行标记处理。大多数情况下，是将滤膜间隔去除，并继而使用显微镜对染色或标记细胞进行手动计数，或使用一种分光光度仪对染色或标记细胞进行评价。这种方法比较耗费人力，因此限制了实验通量，而且，由于进行细胞标记处理，可能会导致基因表达情况的改变，由于标记效率本身的差异性，也可导致实验之间变异情况的发生。而且，显微镜细胞计数并不准确，通常可导致检测结果前后不一致，细胞迁移数据不具有重现性。

图 1 | CIM-Plate 16 产品用于实时细胞侵袭/迁移分析。(a) 图示。检测板以具有两个隔离部分为特征，实验设置较容易。(b)实际产品是塑料制品。
 
CIM-Plate 16 实时细胞侵袭/迁移分析
与上述方法相反，罗氏xCELLigence实时细胞分析仪（RTCA） DP仪器可通过动态记录整体细胞浸润与迁移过程，提供关于细胞迁移的动态信息，而不需要进行标记处理，显著改善了浸润与迁移实验性能。 RTCA DP 仪器使用的是CIM （Cell Invasion and Migration）-Plate 16，以类Boyden小室微孔聚对苯二甲酸乙二酯（PET）膜朝下的一面上具有集成微电子传感器为特征（图 1）。化学趋化物质的趋化作用下，上层间隔小室细胞可通过微孔膜从上层小室迁移至底层小室，迁移过程中，细胞可与微孔膜朝下一面上的电子传感器接触并可粘附至传感器上，从而导致电阻增加1。电阻增加的程度与微孔膜朝下一面上的迁移细胞的数量之间具有相关性，使用RTCA DP仪器持续并自动记录反映电阻变化情况的细胞指数值（图2与3）。因此，可通过细胞指数情况对细胞迁移活动进行监测。

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实验设计
以下是于RTCA DP仪器上，使用胎牛血清（FBS）作为化学趋化性物质，进行的一种基础性迁移实验方案。对该实验方案进行优化处理，以用于两种癌细胞系：人纤维肉瘤细胞系，HT1080，以及一种人宫颈癌细胞系，Hela。如果使用的是不同类型的细胞系或化学趋化性物质，则需要对实验条件进行进一步的优化处理。（i）细胞应该于不含血清培养基中生长，并生长4-24小时。（ii）对于侵袭性实验来说，将培养基（含有或不含化学趋化性物质）加入至底层小室前，对CIM-Plate 16顶层小室进行Matrigel（BD）包被处理。（iii）将顶层小室置于底层小室上面，并将两者扣合在一起，以进行CIM-Plate 16的装配。（iv）在获得背景测定前，将不含血清培养基放置于顶层小室中进行水合处理，并将过滤膜放置于CO2孵育箱中，37℃环境下，1个小时，进行预孵育处理。（v） 于不含血清培养基中，对细胞进行轻柔的胰酶消化处理，使细胞成团状，然后再重新悬浮细胞。（vi） 对CIM-Plate 16 进行平衡处理后，将CIM-Plate 16放置于RTCA DP仪器工作站中，并进行背景细胞指数值测定。（vii）然后从RTCA DP仪器站中移除CIM-Plate 16，并将细胞加入至顶层中，细胞密度为理想密度。（viii） 将CIM-Plate 16放置于RTCA DP 仪器站中，并在几小时内，每隔2分钟对细胞迁移情况进行监测。

HeLa 细胞迁移
我们对底层小室中含有或不含有10%FBS培养基中的两种密度的HeLa 细胞进行了分析（图 2）。由RTCA DP仪器对细胞迁移动力学情况进行记录，共记录18小时。通过自动实时监测，很容易区分并检测出细胞迁移动力学情况。细胞指数值可反映出种植密度情况，通过细胞指数值测定可对较低及较高的种植密度情况进行定量监测。这样测定出的细胞计数值与实验终止时，通过对细胞进行固定与染色处理，而手动测定的细胞计数值之间具有相关性。

图 2 | 通过对活细胞迁移进行持续监测所显示的HeLa细胞迁移动力学。结果表达为均值±标准差(n = 4)。插图为实验结束后微孔滤膜朝下一面染色的迁移细胞的具有代表性的成像图（使用Diff-Quick染色试剂盒； Fisher）。标尺：1630 μm。

HT1080 细胞浸润与迁移
添加入10%的FBS后，我们分别对含有以及不含有Matrigel情况下的细胞侵袭与迁移动力学情况进行了监测（图3）。无血清情况下，我们观察到无或极少见细胞迁移情况发生。正如细胞指数所反映的，细胞侵袭与迁移受到Matrigel浓度的影响，细胞侵袭与迁移表现为剂量依赖性。通过对目前迁移情况的评估，以及实时监测，可较为容易地对细胞侵袭的发生与几率进行定量测定。细胞指数信号的延迟（图 3） 是由于细胞通过Matrigel侵袭所需时间的延搁，并取决于所使用的Matrigel的浓度。

图 3 | 使用FBS作为化学趋化物质，在指定Matrigel稀释液中，HT1080细胞的浸润与迁移动力学。在未包被孔（迁移）或Matrigel包被孔（侵袭）中，HT1080细胞的种植密度是2 × 104个细胞每孔。结果表达为均值±标准差(n = 4)。预包被处理于37℃环境下进行，处理时间为4小时。

结论
特异于化学趋化物质刺激或matrigel浓度，癌细胞显示出不同的迁移与侵袭特性。新的RTCA DP 仪器的CIM-Plate 16是进行细胞侵袭与迁移分析的一种通用产品，目前也是唯一的一种在不进行外源性标记情况下，可实时对细胞侵袭与迁移进行定量测定的产品。该产品可进行侵袭与迁移时间点确定，可有助于通过缩短实验时间而增加实验通量，最小化终点实验数量并有助于确定抑制剂研究的最佳时间点。而且，使用xCELLigence 系统进行分析可减少手动细胞操作步骤，从而使检测结果更加接近生理状态。

预计在2009年的秋天，CIM-Plate 16 将上市。关于xCELLigence系统详细信息请访问http://www.xcelligence.roche.com/。

仅用于生命科学研究。XCELLIGENCE是罗氏公司的一个商标。Matrigel 是Becton、Dickinson 公司的一个商标。其他品牌或产品名称则是各自所有者的商标。

1. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B. & Zheng,W. Application of real-time cell electronic sensing （RT-CES） technology to cell-based assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 363–372 （2004）.
                                                 
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