进行优质的科学研究：鉴定细胞系的遗传特征[创新技巧]

前言

   能够重复出科研领域中已经发表的结果，对于确认、证实科学发现是十分重要的。如果数据无法重复，那么是否有人会追随这个工作就十分值得怀疑了。很多生物医药的研究都采用培养细胞来进行，这些细胞可能是从细胞库（如美国ATCC，American Type Culture Collection）得来，也可能是受赠于其它研究人员。据估计，15-20%的时间里，实验中所使用的细胞已经不是原来的细胞系，或者与其它细胞系发生了交叉污染(1-3)。ATCC，以及其它细胞库（Coriell Institute for Medical Research, European Collection of Cell Cultures (ECACC), Deutsche Sammlung von Mikrorganismen and Zellkulturen (DSMZ), Japanese Collection of Research Resources）都收到过提交的“错误”的细胞系，尽管提交者把细胞系提交到上述机构之前，还经过了检验。然而，最终证实这些细胞系还是鉴别错了(4,5)。此外，干细胞也可能被污染，作为干细胞赖以增殖的哺育细胞层，小鼠细胞很容易污染到干细胞中。显然，细胞系遭到污染、特征鉴别错误，将会极大地威胁着基于这些细胞而发表的论文的质量和研究发现的正确性。为此，很多细胞库现在都要对提交来的细胞系进行鉴定，并对细胞系之间的交叉污染进行监测。

 
             直到他们发现所使用的HeLa细胞系表达了Y染色体标记物之前，一切都进展得非常顺利。

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关于此问题的历史观点

   HeLa细胞系建立于1952年，是第一个人源的癌细胞系。在随后的15年里，陆续建立了多种不同组织的人源细胞系(6)。1968年，研究人员发现许多培养细胞的特征都与原始细胞株的特征不符。这是第一个证据，证明某种细胞培养方法可能会导致细胞出现不可预测的变化，或细胞特征被错误地辨识。无菌技术的进一步发展降低了交叉污染的可能性，几乎没有检测方法能够证明哪种细胞已经遭受了上述影响。然而，从那时起，操作快速而又成本低廉的标准化方法应运而生。虽然这些改进方法应该消除许多细胞间的交叉污染，但是，交叉污染仍然是一个突出问题。ATCC和其它细胞库现在正对他们所提供的所有细胞系进行交叉污染监控和遗传特征鉴定，但是对于绝大多数研究人员，在他们的研究中并不执行这些看似过分谨慎的鉴定程序。加利福尼亚大学伯克利分校的Gertrude Buehring 和其同事在2004年对接近500位生物学家进行了一项调查，发现事实上仅有不到一半的研究人员按部就班地对他们使用的细胞系使用任何一项常规技术进行验证，如短串联重复序列（STR）分析的DNA指纹图谱（6）。如果所有的细胞系都不经检验和证明，则细胞系被错误地辨识将是一个非常严重的问题。

进行细胞系鉴定可节约时间和金钱

   除了会导致数据前后不一致或令人质疑外，交叉污染还会浪费时间和金钱。 Mordechai Liscovitch是一位以色列研究人员，他说他和其实验室的研究人员在两株乳腺癌细胞系（MCF-7和MCF-7/AdrR，现在被重命名为MCI/ADR-RES）上花了3年时间，他们开始认为这两株细胞系是具有相关性的，但后来才发现这两种细胞系实际上并不相关。尽管早在1998年，有些科学家就怀疑人们错误地判断了这两个细胞系的“身份”，但是直到最近才证实了这一论断(4,7)。开始，人们都认为MCI/ADR-RES来源于乳腺癌细胞系MCF-7，而事实并不是这样—它来源于卵巢癌细胞系OVCAR-8（7）。这三个细胞系都属于NCI-60类，后者是药物筛选所常规使用的细胞系(4)。

   Liscovitch 实验室就曾放弃了论文的发表，就是因为使用了被错误辨识的细胞系而导致了错误的结论。然而，还有未知数量的研究工作已经发表，而这些结论是基于被错误辨识的细胞系而得出的。南加利福尼亚大学和洛杉矶儿童医院儿科临床研究所的Charles Patrick Reynolds建立了儿童癌细胞系，并使用已有的多个细胞系进行了抗癌药物研究。 据他估计，已发表的细胞生物学文献中，高达35-40%的论文都需要撤回，因为这些文献中都含有无效数据。这一估计引起了美国天主教大学Roland Nardone的注意，他号召广大研究机构进行细胞系的鉴定工作 — 美国国立卫生研究院（NIH）和美国癌症协会这样的主要机构应该将细胞系鉴定作为给予基金资助的条件，同时在主要杂志中发表的基于细胞培养的相关研究也需要进行细胞系的鉴定。他还要求对技术人员和科学家进行关于预防和检查细胞系交叉污染的教育，包括对这些提议方针的相关专业团体认可机构、主办会议和研讨会的教育，以便于推进这一标准被广泛接受。Nardone博士认为这些改变对科学研究至关重要，这一信念甚至使他参与创建了“全球细胞系鉴定认知月”[2008年5月] — 由一些专业科学家发起的活动，针对细胞系被广泛地错误辨识和交叉污染所造成的混乱和浪费。

   少数机构已经认识到了交叉污染的问题，如ATCC（7）和FDA，这些机构要求对用于制药领域的实验中所使用的材料 — 诸如细胞系 — 应该进行“身份鉴定”和纯度测试（8）。Nature杂志最近也要求报告新的人类胚胎干细胞系的文章提供STR指纹图谱数据，但没有对其它细胞系进行要求(4)。虽然一些杂志和基金组织认识到了细胞系被错误辨识的问题，但是他们还不确定如何能够最好地解决这些问题。应该在什么时候要求研究人员确认细胞系身份，是在审核前还是审核后？用于证实作者的细胞系身份的参照资源从哪里来？

  细胞系被错误辨识不仅会浪费时间和金钱、导致结果前后不一或不可重复、或文献被退回，还可能对人类健康产生潜在的威胁。药物、疫苗和其它生物药物都是以实验室的研究发现为基础而产生的，往往都是跟细胞培养相关。基于误导性的或虚假的数据而制造的药物产品将会导致该药品全面投产的延迟，同时还推迟了针对多种疾病的有效治疗手段的推出。研发治疗手段的时间越长，遭受疾病困扰的人数就越多。

基于STR的方法可以轻松、快速地鉴定细胞身份

  所有这些问题都可以通过价格低廉的方法来解决，这一方法目前被用于鉴定细胞系的标准程序，但是这一鉴定过程必须要进行。 Roderick MacLeod 及其同事在DSMZ发现约有90%的科学家在提交新细胞系时，忽视或拒绝细胞库的要求，他们抵触建立细胞系DNA指纹图谱以备将来鉴定细胞系使用(5,7)。研究人员需要在他们从事研究的早期就接受教育，知道如何检测种系内和种系间的交叉污染，并了解为什么这样做会如此重要。

  在细胞培养中可以使用许多方法对交叉污染进行鉴定，如同功酶分析、染色体组分型、人淋巴细胞抗原（HLA）分型和扩增片段长度多态性（AFLP）的特征分析。但是，比较好的方法是STR图谱法，此方法是在以DNA为基础的法医鉴定领域成功建立起来的。在ATCC，STR分析使用的是多重PCR（Promega PowerPlex®1.2系统），可以同时扩增8个STR位点加1个性别决定位点Amelogenin（10，11）。每个被分析的人源细胞系都有其独特的DNA重复模式，因此通过与基础图谱进行比对，即可对每一批新细胞系的身份进行确证。STR方法防止了ATCC将其6个“错误”细胞系进一步传播出去 — 因为经过STR分型后，发现原本来自女性的细胞系中存在着Y染色体特异的扩增产物。此研究团体希望STR图谱技术能够作为全球范围的检测并消除细胞系污染的参考技术。

图1 . A：Cell ID™系统的等位基因大小范围。使用Cell ID™系统扩增STR片段，使用不同的染料进行标记，通过毛细管电泳进行片段大小分离。每个样本中都有一个标准品以确定被检样本的大小。JOE标记的位点为灰色。Fluorescein标记的位点为白色。CXR标记的内标600片段为黑色。B：K562细胞系DNA图谱。使用Cell ID™系统扩增并进行毛细管电泳检测后，样本数据显示为一系列染料标记的等位基因峰。

图2. Cell ID™系统鉴定细胞系污染。 A：HEK293细胞系的STR图谱。B：污染有29%HeLa细胞系的HEK293细胞系的STR图谱。C：HeLa细胞系的STR图谱。使用Maxwell® 16Cell LEV DNA纯化试剂盒纯化DNA，细胞数为104个，并使用Cell ID™系统进行扩增。扩增产物通过毛细管电泳进行分析。为了简化问题，仅显示了JOE标记的等位基因图谱。

Cell ID™系统能够为您提供基于STR的细胞系身份认证

   Promega公司是STR分型系统的主要供应商，在法医和亲子鉴定方面具有领先优势，其PowerPlex®1.2 STR分析系统（PowerPlex® 1.2 STR analysis system）已经成为细胞培养机构进行细胞系鉴定的“金标准”。为了满足使用更简便地进行细胞系鉴定的需要，我们研发了Cell ID™系统（Cell ID™ System(a,b)），并对此系统进行了改进，提供了能够成功而简便地鉴定、鉴别人源细胞系和检测种系内细胞系交叉污染的试剂。

  Cell ID™系统使用STR分型技术，同时扩增特异性强、具有高度多态性的10个位点（9个STR位点和性别识别位点Amelogenin；包括D21S11，TH01，TPOX，vWA，Amelogenin，CSF1PO，D16S539，D7S820，D13S317和D5S818），三色荧光标记。这些位点组合所提供的遗传图谱的随机匹配概率为29.2亿分之一。 该系统包括一个热启动的Taq DNA聚合酶，可以方便地在室温条件下组装反应组分。 扩增后，采用单次注射毛细管电泳对样本进行分析，同时结合使用所提供的标准品，用以帮助确定不同位点的等位基因的大小（图2）。使用等位基因分析软件确定遗传图谱。

  即使大多数科研人员所在的实验室没有进行STR分型的设备，他们仍可通过具备仪器（毛细管电泳）、软件和经验的研究所中心实验室和专业服务公司来完成STR分型。 文献中，通常建议研究人员在培养细胞的较早阶段（细胞培养第一周）来鉴定细胞系的身份。细胞在被冻存前应再一次进行鉴定；对于活跃生长的细胞，每两个月应鉴定一次；文献发表前也应对细胞系身份进行鉴定。如果一个实验室使用不止一种细胞系，则应在实验最开始时，就要对所有的细胞系进行鉴定，以便排除交叉污染(8)。

总结

  由于细胞培养体系在生物药物的研究和技术发展中非常重要，适当的细胞系鉴定过程即成为每个研究人员的最大兴趣点。然而，交叉污染的问题仍然存在。随着世界范围内实验室使用新细胞系的数量增多和频率增加，在质量控制（如：细胞系鉴定）的基本原则上产生了巨大的差别。从已经发表的、使用“错误”的细胞系而导致可疑性结果的研究论文，到用于临床的干细胞系和其它细胞系，交叉污染影响到了科学研究的每个领域—从实验台到临床。如果在细胞培养的处理和操作中不进行重大变革，那么交叉污染将会成为一个更大、更严重的问题。

参考文献
1. Drexler, H.G., Dirks, W.G. and MacLeod, R.A.F. (1999) Leukemia 13, 1601–7.
2. Drexler, H. G. et al. (2001) Blood 98, 3495–6.
3. Cabrera, C.M. et al. (2006) Cytotechnology 51, 45–50.
4. Chatterjee, R. (2007) Science 315, 928–31.
5. MacLeod, R.A.F. et al. (1999) Int. J. Cancer 83, 555–63.
6. Buehring, G.C., Eby, E.A. and Eby, M.J. (2004) In Vitro Cell. Dev. Biol. 40, 211–5.
7. Liscovitch, M. and Ravid, D. (2007) Cancer Lett. 245, 350–2.
8. FDA. General Requirements for Laboratory Controls. 21 CFR
211.160 and 21 CFR 610.18.
9. ATCC Connection Newsletter (2007) 27, 2–4.
10. ATCC Connection Newsletter (2000) 21, 1–2.
11. Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad .Sci. USA 98, 8012–7.

操作手册
Cell ID™ System Technical Manual #TM074 (www.promega.com/tbs/tm074/tm074.html )

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产品	包装规格	目录号
Cell ID™ System	50次反应	G9500
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(a) 本产品经USB公司授权许可进行售卖，可以在法医和遗传鉴定领域应用，不能应用于与移植或其它医疗操作相关的组织分型。 如需获取更多许可信息，请联系USB公司，26111 Miles Road, Cleveland, OH 44128。
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