酶标法检测三聚氰胺的步骤

　　

美国Beacon三聚氰胺定量检测试剂盒

使用说明书

适用
三聚氰胺检测试剂盒是利用酶联免疫吸附测定法用食品及饲料中三聚氰胺的定量测定。

检测原理
酶联免疫吸附测定法定量测定三聚氰胺残留。利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。先将三聚氰胺酶标记物，样品萃取物及标准加入到已经包被有三聚氰胺抗体的微孔中开始反应。在30分钟的孵育过程中，样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，孵育30分钟后洗掉小孔中所有没有结合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标记物。在用去离子水清洗结束后，每孔中加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。孵育30分钟后停止此反应，根据各孔颜色深浅进行数据读取。依据标准的颜色得出样品中三聚氰胺的的浓度值。

提供试剂及材料
试剂盒在2-8℃贮存（不要冷冻），请于盒上标注日期前用完。
空包装微孔板 （8×12条）.
4瓶三聚氰胺标准液2mL，浓度分别为 0,20,100, 500 ug/L (ppb) .
1 瓶 7 mL 三聚氰胺酶标记
1 瓶 14 mL 底物.
1 瓶 14 mL 停止液. (注意: 1N 盐酸, 勿接触皮肤!).
操作说明书.

注意事项
最好配套使用Beacon所提供的试剂，不要同其它公司的产品混用，不要将不同批次的产品混用。
样品稀释或含有杂质很可能对结果的准确性有影响。
不要使用过期的产品。
使用之前将所有试剂回升至室温20-28℃，但不要放置超过24小时。
三聚氰胺属于有毒性的化学品，请小心处理。
停止液是1N盐酸，避免接触皮肤。

试剂盒未提供的材料
蒸馏水或去离子水..
可吸取50ul的移液器及吸头.
可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸头.
吸水纸或相当的吸水材料.
450nm的酶标仪.
计时器.
洗瓶
混旋器.
20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸馏水定容至1000ml.

样品制备
湿的宠物食品萃取方法（稀释倍数：100）
均质样品至布丁状。
称取2g样品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并剧烈振荡。
超声萃取1分钟。
漩涡混合1分钟，然后静置5分钟，使样品分层。
3000 g 室温离心5分钟。
用玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于一干净试管中。
用样品稀释液将滤液20倍稀释（如：0.1mL滤液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
移取150 ul 进行分析。
注意：用此方法测定了8个添加有15ppm三聚氰胺的猫粮（非要求召回），回收率范围为75%-117%。
本方法只可作为样品筛选方法，不可作为最终确认方法。

小麦面筋蛋白萃取方法：（稀释倍数：500）
1.均质或混匀小麦面筋蛋白样品。
2.称取0.2g均质好的样品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。
3.漩涡混合并超声萃取，使样品溶解（确保样品中没有结块）。
4.用样品稀释液稀释萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。
5.10000转/分离心上清液10分钟。
6.用G6玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于一干净试管中。
7.移取150 ul 进行分析。

注意：如果样品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液，以保证萃取效率。
操作人依据自己的判断力，如果测试结果比较高，需要加入两倍的萃取溶液（0.2/20mL），进行二次测定。

干的宠物食品萃取方法（稀释倍数：200）
1.质器均质干的宠物饲料样品。
2.称取1g样品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并剧烈振荡。
3.超声萃取1分钟。漩涡混合1分钟，然后静置5分钟，使样品分层。
4.3000 g 室温离心5分钟。
5.用G6玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于一干净试管中。
6.用样品稀释液将滤液20倍稀释（如：0.1mL滤液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul 进行分析。