细胞分离三步曲之一：密度梯度离心[选购宝典]

密度梯度离心作为最古老的细胞分离技术，在不断地更新。技术在更新，产品也在更新。

密度梯度离心（density gradient centrifugation）是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分离。这种分离又可分为速率沉降和等密度沉降两种。速率沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。等密度沉降（isopycnic sedimentation）在离心后细胞沉降于密度梯度液中与自身密度相同的密度平衡点，适用于分离密度不等的颗粒。

沉降介质应当是无毒的，可在需要的密度范围内形成梯度，pH值和渗透压可以调节，在高密度时也不粘稠，并能保持细胞或颗粒的完整性。

常用的沉降介质有哪些？你是不是马上就想到了Ficoll和Percoll，没错，那可是GE的明星产品之一，已经畅销几十年了。Ficoll是聚蔗糖，常用的Ficoll-400，分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影酸钠以增加密度，就形成了平时常用的Ficoll-Paque PLUS。Percoll是一种经聚乙烯吡咯酮涂层(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。该法是纯化细胞、亚细胞颗粒和大的病毒的一个较好的方法，但操作流程较长，手续较多。下面我们就对这些介质进行详细的介绍：

Ficoll PM400
Ficoll PM400是中性、亲水的蔗糖聚合物，平均分子量为40kD。一直以来它都被用于形成密度梯度，来分离和提取真核细胞、细胞器和细菌细胞，以及分离淋巴细胞的稳定剂和分离介质。它还可以用于制备培养基、核酸杂交、电泳和免疫研究。Ficoll PM400的渗透压性质比蔗糖好，浓度达到50%时密度可以达到1.2 g/ml。因为它的分子量高，且可透析物质含量低，所以Ficoll PM400通常不会渗透细胞膜。

在离心时，大家通常会调整培养基的密度和粘度，让颗粒以合适的速度沉降。合适浓度的蔗糖则渗透压太高，会伤害细胞。而如果你换用蔗糖聚合物Ficoll，你就可以得到想要的密度，也不会显著增加渗透压。这样你就能够保持细胞完整，并维持细胞活力。因此Ficoll取代了蔗糖用于密度梯度离心，并主要用于常规的细胞分离。Ficoll还是分离淋巴细胞的Ficoll-Paque PLUS的主要原料。

Ficoll-Paque PLUS
Ficoll-Paque PLUS就是我们经常说的淋巴细胞分离液，在市场上销售了30多年，从事免疫学研究的人估计都不会陌生。Ficoll-Paque PLUS是无菌的、即用型的Ficoll-泛影酸钠，有着合适的密度、粘度和渗透压，能够简单快速地从人外周血、骨髓和脐带血中分离淋巴细胞。它的内毒素水平非常低，小于0.12EU/ml。

除去了纤维蛋白或抗凝剂处理过的血液加入Ficoll-Paque PLUS溶液中并离心。离心中的差异迁移就导致了溶液的分层，每层包含了不同的细胞类型。最底层包含Ficoll聚集的红细胞以及沉淀物。紧挨着上面的Ficoll-Paque PLUS一层包含了大部分粒细胞。淋巴细胞因为密度低，最终停留在血浆和Ficoll-Paque PLUS的中间层。这一层还有其他沉淀慢的颗粒，如血小板和单核细胞。吸取中间层，用平衡盐溶液短暂洗涤，以除去血小板、Ficoll-Paque PLUS和血浆，就可以得到单个核细胞。且分离所得的细胞中95±5%为单个核细胞，细胞存活率> 90%，回收率为60±20%。

由于这种方法还可以稍作变动用于很少的血液，因此Ficoll-Paque PLUS还特别适合从有限的血液（如来源于尸体或小孩）中分离淋巴细胞。

Ficoll-Paque™ PREMIUM系列
Ficoll-Paque PREMIUM系列产品为无菌、即用型的密度梯度介质，可用于分离单个核细胞。所有的Ficoll-Paque PREMIUM产品内毒素含量很低 (< 0.12 EU/ml)，并在严格控制的环境下加工生产，生产条件符合ISO 13485:2003 标准和GMP 认证。

Ficoll-Paque PREMIUM包括1.073、1.077、1.084 g/ml 的不同密度梯度产品，可用于从外周血、骨髓和脐带血分离不同密度制备的单个核细胞。

经典的密度为1.077 g/ml的Ficoll-Paque PREMIUM是由Ficoll-Paque PLUS 发展而来。唯一的不同之处在于，Ficoll-Paque PREMIUM的生产加工过程符合ISO 13485:2003标准、GMP认证以及美国药典推荐的用于生产加工细胞治疗相关产品的标准。

Ficoll-Paque PREMIUM 1.084可用于分离较高密度的人单个核细胞，还可用于分离小鼠和大鼠的血细胞，因为啮齿动物的淋巴细胞密度比人的稍大。Ficoll-Paque PREMIUM 1.073则用于分离较低密度的人单核细胞，如基质细胞和单核细胞。

Percoll & Percoll PLUS
Percoll 是一种硅胶介质，用于密度梯度离心分离细胞。该介质的硅颗粒表面有一层聚乙烯吡咯酮涂层 (PVP), 从而使其渗透压和粘度降低。用Percoll 分离细胞时，应在温和的条件下进行，这样有助于多种细胞、亚细胞颗粒和病毒的分离。它渗透压低，很容易用生理盐水、其他平衡盐溶液或细胞培养基调整，在1.0至1.3 g/ml的密度范围内可以形成等渗Percoll 梯度。该密度范围经最优化设计旨在用于分离那些在Percoll 中浮力密度为1.0至1.2 g/ml 的大多数细胞，亚细胞颗粒和小至70S的病毒。

Percoll PLUS 与Percoll类似，但内毒素水平更低（最高2 EU/ml），非常适合在各种临床研究应用中进行细胞分离。文献中描述的应用Percoll 的所有实验都可以用Percoll PLUS 进行。Percoll PLUS 可用于建立预形成梯度、连续梯度或不连续梯度。在中等离心力作用下，由Percoll PLUS组成的胶粒沉淀形成平滑、连续的密度梯度。密度梯度的形成可使用离心机固定角度离心转头和悬垂转头。Percoll PLUS介质也很适用于需要高速离心的应用。在这种情况下，标本可以与介质预混合，随后在原位 (in situ) 形成的连续梯度上进行分离。这样, 就可以一步完成梯度形成和标本分离。

密度梯度离心作为最古老的细胞分离技术，也在不断更新。它与标记技术相结合，能更快地分离目的细胞。StemCell Technologies公司就提供了这样的分离方法，叫做RosetteSep。这种专利技术是在四聚体抗体复合物（TAC）的基础上发展起来的。RosetteSep将全血中不需要的细胞通过TAC与红细胞偶联。标记之后，将样品铺在沉降介质如Ficoll中，通过离心，标记的细胞就与红细胞一起沉淀，而想要的非标记细胞就可以从中间层中回收。RosetteSep能够应用于淋巴细胞和髓样细胞的富集，AIDS研究中T细胞的分离等很多方面。这种方法非常快，而且目的细胞未标记任何东西，是未触碰的（untouched）。所以很受研究者欢迎。

但是，如果你想从淋巴细胞中进一步分离B细胞和T细胞，恐怕离心就无能为力了，那么就把这个任务交给磁珠分选或流式分选吧。（待续）

(生物通 余亮）