ChIP：基因组学与蛋白质组学的连接[选购宝典]

    生物通技术专栏：染色质存在于真核生物细胞核内，由蛋白（组蛋白、酶和转录因子等）以及DNA和RNA分子组成。染色质参与了许多主要生物过程的调节，包括细胞特异性或组织特异性的表达模式、DNA复制及修复、基因表达的机制。了解基因表达在体内如何进行成为现代生物学最诱人的挑战之一。染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）在这个背景下应运而生，成为目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。与传统的EMSA技术相比，基于体内分析而发展起来的ChIP能更真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究基因表达的机制、建立遗传网络、鉴定转录因子和它们的靶点的最常用方法。

 

    ChIP还可与DNA芯片和测序技术相结合，用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入理解DNA-蛋白质相互作用的调控网络，了解一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。

 

    基因组学和蛋白组学都将把染色质作为研究对象，但两个领域采用的方法各异。在基因组学研究中，研究人员通常从一个蛋白质开始研究，采用ChIP去找出与基因组关联的蛋白质。而蛋白组学研究采用的是反向方法，先用一个特殊的DNA序列作为寻找蛋白质的诱饵；然后用ChIP去证实：那些蛋白质就是在体内与DNA序列相关联的蛋白质。

 

    ChIP的原理很简单，就是选择性地富集包含某一特定抗原的染色质片段。传统的ChIP包含以下几个步骤：甲醛处理使蛋白质与DNA交联；超声波将染色质打断成一定大小；通过抗体沉淀蛋白质－DNA交联复合体；用蛋白酶K处理，解除交联，纯化DNA；实时定量PCR检测DNA的量。虽然ChIP技术的原理不复杂，但是对技术的要求高，实验步骤的设计摸索耗时耗力，实验耗费时间长。

 

ChIP实验的几个关键因素：
1. 抗体
    对于ChIP实验来说，抗体的选择可以说是至关重要。首先，应该检验抗体的特异性。我们可以用ELISA和Western blot来确认抗体是否识别特异的表型。但是充分的验证也不能确定抗体一定能在ChIP中起作用，因为交联处理可能会使某些表型改变或丢失。尽量避免使用识别多个抗原的抗体。最好选择ChIP级别的抗体，如果实在找不到，普通IP的抗体也是一个不错的选择。其次，抗体的量和使用的条件都应该根据使用经验来确定。一般情况下可以从每50ugDNA使用2-5ug抗体作为起始条件开始摸索。抗体孵育的时间可根据实际情况缩短或延长，如果细胞数量有限的话，还是推荐孵育过夜吧。

 

2. 染色质
    大部分来源的染色质都适合做ChIP。然而由于来源不同，分离的步骤又随之变化，ChIP可以分为两种类型：天然的和交联的，分别简称为N-ChIP和X-ChIP。
1) N-ChIP：以天然的染色质作为底物。这种方法的好处就是抗原不会在化学交联中被修饰。然而，如果缺乏了交联的步骤，就意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀，譬如组蛋白。
2) X-ChIP：以交联的染色质作为底物。X-ChIP应用更为广泛的原因就是能用于研究大范围的染色质结合因子，它们与DNA的结合力较弱。它也适用于酵母的ChIP，因为酵母的天然染色质很难制备。然而，确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式，因为在交联过程中它们的表型会发生变化，或出现包涵体。交联方式通常是甲醛处理。一般需要进行一个时间进程的实验来确定交联的时间。

 

3. 超声波打碎DNA
    在X-ChIP中，超声波处理是打碎DNA最常用的方法，因为甲醛的处理限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化，不过说明书上通常都会给出一个参考条件。注意在整个超声波处理的过程中一定要保持细胞在冰上，且时间不宜太久，否则样品会过热并变性。另外，还要避免产生泡沫，因为泡沫会降低剪切效率。如果出现泡沫，你就要检查一下是不是探头位置不对，刚好接近液面或接触到了管底。

 

染色质免疫沉淀作用在基因组学和蛋白组学研究中的应用越来越广泛。虽然如此，对于使用该技术的新手，它却不是那么容易驾驭的。对于刚刚开始采用ChIP技术的研究人员来说，试剂盒和相关的服务是很有用的，因为技术要求很高。如果不想自己慢慢摸索条件，生物通为你特别介绍市面上主流的商品化产品：

R&D
R&D最新推出了一系列用于ChIP分析的ExactaChip试剂盒，包含FoxP3 (Catalog # ECP3240), beta-Catenin (Catalog # ECP1329), p53 (Catalog # ECP1355), Smad4 (Catalog # ECP2097), 和STAT5a/b (Catalog # ECP2168)。这一系列试剂盒可以简便快速地鉴定转录因子在基因组DNA上的结合位点。在免疫沉淀交联的转录因子-DNA复合物后，用普通的PCR和基因特异的引物来检测转录因子结合位点。每个ExactaChip试剂盒试剂盒包含了一个免疫沉淀的抗体和一对已知转录因子结合DNA序列的引物作为阳性对照。研究者通过自己设计的引物，就可以发现转录因子结合的其他区域。ExactaChip试剂盒的最大特点就是摒弃了耗时的反交联和抗体过夜孵育的步骤，在4-5小时内就能完成整个实验，而传统的方法需要2-4天。缺点就是里面的试剂不全，像蛋白酶抑制剂、链酶亲和素磁珠、DNA纯化试剂盒等都要再另外购买，初次使用者可能觉得不太方便。ExactaChip试剂盒的更详细信息请访问：www.RnDSystems.com/go/ExactaChIP。

 

Promega
    Promega公司也在去年推出了第一个不需要抗体的新颖ChIP系统——HaloCHIP系统。  HaloCHIP系统利用了HaloTag蛋白的特点——能与任何蛋白融合，并与不同的配体包括HaloLink树脂产生共价作用。这样，感兴趣的DNA结合蛋白就可以通过克隆到HaloTag载体上与HaloTag蛋白融合，再转染进入细胞，然后用甲醛处理细胞，裂解细胞，用超声波将染色质剪切成小片段，再用HaloCHIP系统进行纯化和后续分析。传统ChIP系统的最大挑战是很难找到一个能识别交联后表型的高特异性抗体。在HaloCHIP系统中，与DNA交联的重组HaloTag融合蛋白能直接被HaloLink树脂捕获，从而省去了抗体。这个方法的另一个优势是HaloTag融合蛋白与HaloLink树脂的共价结合，在树脂、蛋白和DNA中间产生了一个完整的共价键。这样就可以进行多次洗涤，背景低，信噪比高。与其他亲和标签不同的是，HaloTag蛋白也可以捕获细胞中丰度很低的复合物，因为HaloTag融合蛋白与HaloLink树脂形成的共价键不会解离。HaloTag融合蛋白与HaloLink树脂的结合快速，在几小时内就能完成，节省了宝贵的实验时间。

 

Roche
    Roche旗下的NimbleGen公司也提供一系列ChIP-chip (chromatin immunoprecipitation on chip) 芯片和服务。NimbleGen提供全基因组、启动子和客户定制的芯片，可以满足不同的实验需要。全基因组ChIP-chip包含人、小鼠、大鼠、狗、鸡、蠕虫、苍蝇、酵母、大肠杆菌和拟南芥基因组的非重叠区域，探针间距小于100bp，可用于发现启动子/增强子元件、转录因子结合、组蛋白修饰/替换和Dnase-I超敏位点。NimbleGen的人和小鼠启动子芯片根据最新发表的基因组数据设计，覆盖了所有已知基因的启动子。分辨率高，灵敏度和特异性也非常理想，结果更加准确。

 

Affymetrix
    Affymetrix公司的Tiling Array（嵌合芯片）是迄今为止分辨率最高的基因芯片类型，Tiling Array的探针设计几乎涵盖了目标DNA的全部序列。目前为止，已经开发出了人、小鼠、酵母、线虫、拟南芥等模式生物的全基因组Tiling芯片，为全基因组规模上研究目的蛋白与核酸的相互作用提供了强有力的分析工具。GeneChip® Tiling Array除了全基因组芯片外，还包括了专门应用于ChIP-chip技术中的人启动子和小鼠启动子两款芯片，探针设计覆盖了转录起始位点附近10kb的范围，针对肿瘤相关的1300个基因中，覆盖范围更增加到12.5kb。此外，Affymetrix公司提供了包括GCOS, TAS和IGB在内的完整的数据处理体系，为客户发表高质量的文章提供了强有力的保障。

 

Illumina
    Illumina公司的Chip-Seq技术则融合了ChIP与大规模并行的DNA测序，来鉴定DNA相关蛋白的结合位点。Chip-Seq技术能够精确划算地定位目的蛋白的所有结合位点。研究者可以在几乎所有测序过的生物中研究ChIP。起始样品量少，仅仅10ng就行。Illumina公司的Chip-Seq不需要反复的探针设计和验证，比其他的ChIP方法更高效，也比全基因组ChIP-chip更便宜。最近，Illumina公司还和Genpathway宣布合作提供全基因组染色质免疫沉淀（ChIP）测序服务。首先将用Genpathway的FactorPath ChIP实验来准备样品，然后通过Illumina的测序服务进行测序。最终的数据分析由Genpathway的专利软件分析工具来完成。Illumina和Genpathway的联合服务为研究者提供了一套完整的ChIP测序解决方案，来鉴定和量化整个基因组上转录因子结合位点。

 

abcam
    abcam公司不愧为真正的抗体王国，提供了多种ChIP级别的抗体，专门用于ChIP技术分析，节省去了前面摸索的步骤。除了高质量的ChIP抗体外，abcam还提供详细的ChIP实验方法和该领域最热门的文章，更使得您的实验如虎添翼。ChIP技术的详细信息请访问：

 

Millipore
    Millipore 旗下的Upstate公司最先开发出步骤优化简捷的商业化ChIP分析试剂盒，保证实验的准确性和可重复性，同时Upstate提供广泛可行的ChIP级别应用抗体。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质ChIP级别应用抗体结合完成一个完整的染色质免疫沉淀分析。Magna ChIP™试剂盒中用Protein A或G的磁珠来进行免疫沉淀，使整个操作步骤可以在1天内完成，同时试剂盒中包含了实验所需的所有试剂（除了抗体），省时又省事。且提供了DNA纯化柱，免去了酚/氯仿抽提的烦恼。EZ-Magna ChIP™试剂盒除了包含上述所有的特点，还包含了阳性、阴性对照抗体和对照引物，确保实验结果的重复性和找出实验中的问题。再加上一个ChIP级别的抗体，Perfect!

（生物通编辑余亮）

 

专家经验之谈

阿肯色州医科大学生化和分子生物系副教授Alan Tackett表示，大家都知道酶的催化活性，但是没有人知道活性位点的位置。在他看来，没有这门技术，就无法进行鉴定，也就不可能获得结果。加州大学药理学教授Peggy Farnham也认同这种观点。她说：“如果不知道哪些基因被调节，就不可能获得阳性对照。”Farnham在研讨会上向研究人员讲授ChIP-chip芯片技术新方法，采用该技术，她发现了人类细胞中的新的转录因子结合位点。Farnham等人完成了一个转录因子的ChIP-芯片的不完全定性过程，“从0靶子到7,000个靶子，然后我们能对被这些因子调节的基因进行分类。”

 

与此同时，蛋白组学研究人员通常从已知的目标开始研究，需要对关联的所有蛋白质进行鉴定和测试。因为DNA序列是公开的，所以这些项目通常采用实时PCR方法进行检测，而不是DNA微阵列。

 

例如，宾夕伐尼亚医学院的研究人员最近采用卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的末端重复序列作为色谱柱上的一个亲和标记，然后用柱子去纯化感染细胞的蛋白质。实验得出的结果表明：与柱上的卡波济肉瘤相关疱疹病毒DNA结合的宿主蛋白质有123个。

 

研究人员采用ChIP研究感染细胞，以确定在一个感染期间，实际与病毒DNA结合的原始数量。在随后的实验中，她们用假定的结合蛋白进行免疫沉淀实验，然后用PCR去观察KSHV DNA是否与蛋白质相结合。

 

随着技术的日益普及，研究人员发现了更广泛的用途。Millipore公司细胞信号产品经理Sallie Cassel介绍道：“有位做标准ChIP分析的客户，正在寻找与酒精中毒有关的基因，因此她是从神经科学的角度去进行研究的。”

 

攻克难关

第一个问题是，免疫沉淀作用阶段，研究人员通常会尝试自己以前用过的抗体。Cassel表示：“大家可能会这么想，我研究蛋白质，用抗体与蛋白质相结合，因此我能在ChIP中使用该抗体。然而，在许多例子中，当蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能是无效的。研究人员可能不得不去验证这些抗体的有效性，同时进行阳性和阴性对照，因为采用这些抗体进行研究，可能会遇到很多问题。

 

Farnham建议，对每一个免疫沉淀作用采用多重对照，对初学者来说，有的实验可能会没有结果，Farnham本人设计的应用很广的ChIP实验方案，可以从她的实验室的页面上下载（http://genomics.ucdavis.edu/farnham/）。

 

在理想条件下，ChIP也可能会得出假阳性结果，因此研究人员应该尽可能的对结果进行多方验证。一般的策略是采用遗传学和生化方法相互进行测试。对于蛋白组学项目而言，ChIP本身就是证实分析过程，提供一个真正的校验生化亲和纯化的方法。在基因组学研究中，研究人员应该尽可能了解ChIP前导物的生化特征。

 

Tackett以自己为例进行介绍，他的研究小组用ChIP鉴定组蛋白乙酰化酶结合位点之后，又思考如下的问题：这些位点在活细胞中是否就是真的乙酰化，乙酰化作用是否如预期的效果一样。“当你进行乙酰化作用，实际上推动了转录，因此，我们用实时PCR观察转录活性。”

 

即使有一系列完整的对照，研究人员也应该对最终的结果持谨慎态度。Farnham说：“我认为，研究人员必须时刻思考，他们获得的阵列类型可能会影响最终的发现结果。”如果他们只查看一个启动子阵列，那么只会发现启动子上的结合位点。”而一些调控蛋白质实际上是与启动子区域相隔较远的序列相结合。