生物通技术盛宴7:蛋白样品浓缩沉淀法宝[选购宝典]

 

生物技术盛宴6：蛋白纯化层析柱

2007技术盛宴5:蛋白样品制备中各类杂质/杂蛋白的去除

生物通技术盛宴4：蛋白酶抑制剂的选择

生物通技术盛宴3：磷酸化蛋白和糖基化蛋白的样本制备

生物通技术盛宴2：蛋白样本制备产品大PK

蛋白技术篇之蛋白样品制备

续前

生物通技术盛宴：蛋白质样本制备之三：浓缩和沉淀

经过细胞破碎、分段富集、去除部分杂质等一系列操作，样本的体积不断加大，蛋白质浓度下降，有时已经不适合后继的蛋白质样本检测或者上样了。怎么办？这个时候不外3类选择：浓缩，沉淀，过柱。过柱既然是分离富集的常用方法，自然也有浓缩特定目标蛋白的效果，生物通前文已有介绍。效果最好的自然是专一吸附富集和洗脱的亲和柱，比如HisTag之类的。如果过柱后洗脱浓度还不够，也要继续用其他方法浓缩。亲和沉淀或者免疫沉淀原理也一样----比如琼脂糖偶联抗体做亲和沉淀----借助抗体吸附目标蛋白，借助琼脂糖重力离心沉淀，能有效的富集纯化目标蛋白，缩小体积，而且不影响目标蛋白活性。但是多数情况下，无处可觅亲和的“那一半”，又要继续后继实验，就只好采用浓缩或者沉淀。

浓缩
由于沉淀可能导致或多或少的样本损失，不可逆沉淀等问题，原则上，能不用都尽量不用沉淀的方法。冷冻干燥相对能比较好的保持蛋白质活性，非常有效的缩小溶液体积和提高浓度，而且没有什么损耗和花费。问题是你首先得有冻干机，而且冻干不能去除样品溶液中的盐等其他杂质。

超滤是浓缩样品的更好的选择。超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质，是一种温和的、非变性的物理分离方法，尤其适用于蛋白质等大分子溶液的浓缩，纯化以及缓冲体系交换等。超滤操作最简单的工具莫过于离心超滤管----通过离心力，使溶液中的小分子溶液和溶剂透过超滤膜,被收集在滤过液收集瓶中，而大分子溶质则被超滤膜截流在样品浓缩管中。该方法的特点是操作简便，只需要高速离心机，无需其他特殊设备，速度快，可以相当地有效浓缩样本，而且可以部分去除样本溶液中的盐、去垢剂等可溶性小分子，有利于更换缓冲体系。

操作：离心超滤管的使用非常简单，按照样品量和目标分子量选择适当的离心超滤管，加入待浓缩的样品溶液，按照超滤离心管指示离心速度和时间离心，最后回收滤管中截留的样品溶液。

回收率：一般回收浓度大于0.1mg/ml的溶质，回收率可达90%以上。通常样品损失是由于滤膜表面和容器表面的非特异性吸附引起的。选择口碑好、高品质的离心超滤管非常重要，因为高品质的离心超滤管选用低吸附材质，精细抛光，可最大限度地降低了吸附性。滤膜表面样品的吸附量与样品和滤膜材质有关，一般为2-10μg/cm2。如果研究的对象是滤过液，由于其滤过时要穿过滤膜的整个内部结构，所以吸附量相对较大，为20-100μg/cm2。通常截留分子量高的膜吸附较高，而截留分子量低的膜吸附较低。

eBioTips1：为了得到最高的收率，所选滤膜的截留分子量MWCO建议选择所需截留分子大小的1/3左右，不超过目标分子量的一半。因为超滤膜上孔径是平均孔径，膜上的孔并非均匀，离心高压下也可能渗漏，因此截留孔径越小，流速越慢但截留比例更大。

eBioTips2：如果样本浓度低体积大，可选择较小容积的离心超滤管多次重复加样离心。如果同时需要脱盐和去除可溶小分子杂质，可将待浓缩样品稀释到离心超滤管最大容积再离心，重复2次可除去99%盐。

eBioTips3：避免过长时间或者过速离心，虽然高品质的产品都有防死端设计，可避免过度离心造成膜表面干而造成不可逆吸附。避免过度浓缩，最终体积越小，越容易因表面吸附而损失得率。离心后用Tips轻轻吹吸几次滤膜截留的溶液，必要时补加一定体积的缓冲液冲洗膜表面，有助于减少膜表面吸附，能提高回收率。尽量避免Tips接触膜表面。

eBioTips4：有些置于2ml离心管的那种Mini离心超滤管可以反向套入离心管中离心（管子上下一样宽的那种一般都可以），以方便用离心法回收截留蛋白质样品，可使浓缩液达到近乎完全回收，不用Tips，对于样品体积小的就很好。赛多利斯的Vivaspin 2ml带有一个回收帽，也可以反向离心后可加盖保存回收样品，但是那个管子很长，要配15ml离心管的离心机，不过有几种膜可以选择。

eBioTips5：离心超滤管通常也不能消毒（个别种类特别说明除外，如再生纤维素(RC)膜的离心超滤管可以121度消毒，但是注意那个pH范围比较小，别因为消毒就选错），一次性使用。由于单管价格并不便宜（20-90元），不少人尝试重复使用----经验是用蒸馏水清洗膜表面多次，离心一次到两次，那种可以反向离心的小管子可以加蒸馏水浸泡后反向多离心一次，会好些。可重复用于同一样品，不用时可用蒸馏水浸泡，但是要防止细菌污染。不同样品就不要混用了。有人说用20%酒精，还有人说用1N的NaOH洗涤，但也有人说会破坏膜结构。反正厂家一般不支持重复用。多次重复使用会堵塞滤膜上的孔径，甚至出现漏液现象，影响实验结果。

eBioTips5：离心超滤管通常不需要预处理即可使用（个人经验，用蒸馏水洗一次会好些），不过对于蛋白质样本处理，特别是较稀的蛋白质溶液来说(<10ug/mL),用超滤膜浓缩回收率常常是不定量的。虽然PES材料使非特异吸附最小化，但是,某些蛋白,特别是稀的时候,会有问题。非特异结合的程度随着个别蛋白结构的不同而不同。含有带电的或者疏水结构域的蛋白质更易于不可逆结合到不同表面。对超滤离心管表面做钝化预处理可降低蛋白质在膜表面的吸附性损失，大多数情况下，在浓缩稀蛋白溶液之前预处理(钝化)柱子可以提高回收率，因为钝化溶液可填满膜和表面暴露的空白蛋白吸附位点。钝化的方法是预先用最高容积的钝化溶液预浸泡柱子1小时以上，蒸馏水彻底冲洗柱子，再用蒸馏水离心一次以彻底除去可能残留在膜上的钝化溶液。注意钝化处理后别让膜干了。如果要留待以后使用，需要加无菌蒸馏水保持膜湿润。常用的钝化溶液可选择：
  a. 1％牛血清白蛋白磷酸缓冲液溶液
  b. 5％十二烷基磺酸钠蒸馏水水溶液
  c. 5％Tween-20非离子活性剂蒸馏水溶液
  d. 5％Triton-X 蒸馏水溶液
  e. 5％聚乙二醇化合物蒸馏水溶液
  f.1％免疫球蛋白IgG磷酸缓冲液溶液

eBioTips6：离心超滤管因为需要高速离心，某些对剪切力或压力诱导下易变性的不稳定样品可能不太适合。另外超滤膜上孔径是平均孔径，膜容易堵，对于有微小颗粒或者碎片的样品，最好能先用较大孔径的离心超滤管过滤一次，再进行下一步浓缩。

膜材质：选择超滤膜主要根据膜的材质，截留分子量以及综合性能等，但是超滤的效果取决于待超滤的样品溶液的特性，有条件的可以试试不同材质的膜。没有条件就随大流。聚醚砜PES是超滤离心管中最常见的材质，具有较高的化学和热稳定性，耐碱能力强(pH范围1--14)，通量大，流速快。其他材料还有三醋酸纤维素(CTA)、再生纤维素(RC)和Hydrosart(HY)。三醋酸纤维素（Cellulose Triacetate，pH范围3--11）亲水性强，非特异性吸附极低，溶剂和小分子溶质在过滤时不会因被膜吸附而产生损失，适合样品洗涤、除蛋白以及其他需要回收滤液的操作。再生纤维素（Regenerated Cellulose，pH范围4--8）也是一种高度亲水的膜，对蛋白的吸附极低，可以高压灭菌，容易清洗，耐酸碱性能及耐溶剂性能好。当用于从低蛋白浓度的稀释液中回收蛋白时，可以得到极高的收率。Hydrosart超滤膜（pH范围3--11）是Sartorius公司的专利产品，它的基本特性与再生纤维素类似，Hydrosart在具有极低的蛋白吸附性的同时，又具有高流速和高通量的特性，是免疫球蛋白浓缩和脱盐的理想用膜。

规格：市面上常见的规格，截留量来说从3K, 5K, 10K, 30K, 50K, 100K的都有，从最大容积来说，离心管500ul到20ml的都有，单个价格从20-90。过了年，有空放个表上来比较看。生物通建议所选滤膜的截留分子量MWCO建议选择所需截留分子大小的1/3左右。

品牌的选择：离心超滤管知名厂家有Pall，Millipore，Sartorius和Whatman等等。都是经典的品牌。其中Sartorius的Vivascience超滤离心管采用专利的垂直膜配合狭长的流道（垂直切向流）设计，有效地避免了滤膜阻塞，即使对于含有颗粒的溶液，也能达到高速超滤。PE公司也购买Vivascience公司的专利，PE的蛋白质样本富集试剂盒也是Vivascience设计的。由于他家再生纤维素

另外值得推荐的是Vivapore溶剂吸附浓缩器，不需要任何附加设备，只需把待浓缩的样品加入Vivapore浓缩器中，静置，等达到需要的浓缩倍数后，用吸管回收即可，只是速度会比较慢。溶剂吸附法用于常规目的实验室浓缩或进一步分析前的样品纯化，尤其适用于在剪切力或压力诱导下易变性的不稳定样品溶液，以及需要在低温环境下操作的溶液。处理量：0.5 ml - 20 ml，截留分子量：7.5K/30K。待续