iPS技术的前世今生（下）[创新技巧]

iPS技术究竟是如何发展而来？它又有着怎样的前世今生？请看本文的报道。上篇聚焦了iPS的历史，下篇着重于它的现状和改良。R&D供稿，生物通编译。

同样适用于人类细胞吗？

接下来的一个大问题是，这种4因子结合的方式是否能将人的体细胞转变成类似胚胎干细胞的iPS表型。这种无需使用人体胚胎就能形成患者特异的多能干细胞的优势不言而喻，因而引起了研究人员极大的兴趣。

希望将小鼠的研究结果应用在人体细胞上的研究人员面临了几个挑战。目前人体系统中还没有小鼠系统中的遗传工具。如果效率也是这么低，研究人员不得不在整个诱导群体的大海中寻找iPS这根针，而没有选择的辅助。人细胞中反转录病毒转导效率更低，而且人体胚胎干细胞需要不同的生长环境来维持多能性。尽管如此，人体iPS细胞还是迅速地被三个研究小组攻克并报道。13-15

Yamanaka的小组利用成年人表皮成纤维细胞作为起始群体，并通过将小鼠反转录病毒受体（Slc7a1）引入人体细胞，优化了反转录病毒的转导效率。13根据形态学来分离iPS克隆，随后证实这些克隆表达了人体胚胎干细胞的标志物，包括Oct-3/4、Nanog、Sox2、GDF3、Rex1、Fgf-4、ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT。人体iPS细胞中也同样存在反转录病毒被沉默现象，可以通过体外分化形成具三胚层特有的标志物来证明其多能性。通过每种细胞类型的多个标志物评估，这些细胞也能分化形成多巴胺的神经元以及心肌。iPS细胞在畸胎瘤环境中表现出三系分化。与小鼠的0.1%相比，人细胞的重编程效率更低，只有0.02%。

Thomson的实验室采用了稍有不同的路线来研究人iPS细胞。14为了避免c-Myc转导中潜在的致瘤性，他们开发出另一套重编程因子：Oct-3/4、Sox2、Nanog和LIN-28。另外，他们改造了人类胚胎干细胞的选择系，用内源的Oct-3/4启动子来控制抗药性基因的表达。利用这个方法与Takahashi和Yamanaka最初的小鼠方法类似的线路和策略，他们从14种可能的重编程因子起始，最终缩小到4个候选因子。然而，他们没有采用包含选择标记的体内分化组织，而是采用由改造的胚胎干细胞体外分化而来的细胞，并利用4个重编程因子让分化的ES细胞逆转退回到未分化状态。随后他们利用胚胎及新生儿的成纤维细胞，证实了这4个因子重编程人原代细胞的能力。如Yamanaka小组产生的细胞一样，这些iPS细胞也表达典型的胚胎干细胞多能性标志物，并在畸胎瘤分析中分化成全部三个胚层的细胞。

第三个构建人类iPS细胞的小组由Daley领导，也是起始自遗传改造利用Oct-3/4作为筛选标记并分化的人胚胎干细胞。15胚胎干细胞来源的成纤维细胞通过最初的4个因子组合Oct-3/4、SOX2、KLF4和c-Myc进行反转录病毒转导，iPS细胞的分离效率相对较高，达到0.1%。为了证实原代细胞也能被重编程，他们利用了两种类型的胚胎成纤维细胞，并成功产生了iPS克隆。然而，除非再加入两种因子：hTERT和SV40大T抗原，否则从进一步发育成熟的细胞——包括新生儿成纤维细胞、成体间充质干细胞和成体成纤维细胞中都分离不到iPS克隆。Park等也研究了人iPS细胞的甲基化模式，并表明它们更类似于人类胚胎干细胞，而不是母体的成纤维细胞。15

为了解答是否某些细胞类型能比其他细胞更容易被重编程的问题，研究人员在随后集中研究小鼠不同的起始细胞群。例如，Yamanaka的小组检测了来自成体小鼠肝和胃的上皮细胞。16结果表明，原代肝细胞和胃上皮细胞这两种细胞在Fbx15的激活作为筛选标记的情况下转导Oct-3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，都可以转化为iPS细胞。这些iPS系都生成了畸胎瘤并可最终形成嵌合体成体小鼠，其中部分还可以进行种系传递。有趣的是，这些结果与他们之前的工作并不一致，9,10此前的结果表明胎鼠或鼠尾成纤维细胞，在Nanog而不是Fbx15的选择标记下，可转化为有种系传递能力的iPS细胞。与成纤维细胞来源的iPS系相比，这些源于内胚层的iPS细胞的成瘤性也有不同，胃和肝iPS细胞发生肿瘤的情况要少得多。这些差别显然是由于c-Myc在胃和肝细胞的重编程过程中的并不重要。Stadtfeld等利用产胰岛素的小鼠胰腺β细胞作为起始细胞群，证实其重编程效率与成纤维细胞相当（0.1-0.2%）。17因此，至少在小鼠中，不同器官来源的多种分化完全的细胞都能被成功地重编程。

有没有更安全的iPS细胞？

普遍的看法认为目前制造iPS细胞的方法并不适于应用在临床。忧虑不仅限于c-Myc，还包括众多的反转录病毒整合位点，它们本身有能力导致突变或致癌。因此，避免采用c-Myc、总体采用更少因子的重编程，或最终用小分子来取代这些因子，更合乎理想。为此目的，Nakagawa等进行了研究，18表明小鼠或人类成纤维细胞在没有c-Myc的情况下也能产生iPS细胞。这种3因子诱导的iPS细胞在转导与用筛选试剂进行筛选之间需要更长的间隔，表明在缺少c-Myc时重编程过程更慢。产生的细胞可形成成体嵌合体，且不会导致肿瘤。人皮肤成纤维细胞也能够在无c-Myc的条件下重编程，与有c-Myc相比效率则低很多。

为了将所需的外源因子数量减至最低，Kim等试图以内源高水平表达重编程因子的细胞群作为起始细胞群。19例如，成体小鼠神经干细胞（NSC）高水平表达内源的Sox2和c-Myc，因此可能需要更少的外源因子。实际上，成体神经干细胞只需要两种因子Oct-3/4和Klf4或者Oct-3/4和c-Myc就能产生iPS细胞。这些“2因子”的iPS细胞表达了典型的胚胎干细胞标志物，并在畸胎瘤和嵌合体中产生全部三个胚层。此外，嵌合体小鼠中没有观察到肿瘤产生。毫无疑问，研究人员很快就会在人类神经干细胞中检验这种方法。

在另一项旨在筛选能替代一种或多种重编程因子的小分子的研究中，也选择了神经干细胞作为起始细胞群。Shi等鉴定了一种G9a组蛋白甲基转移酶的抑制剂（BIX）能改善两种因子转导的神经干细胞的重编程效率。20另外，BIX的存在能让小鼠胎儿神经干细胞在有其他三种因子但缺乏Oct-3/4时产生iPS细胞。

机制

关于iPS细胞，至今仍有许多让人迷惑不解的问题，尤其是重编程发生的机制。几个实验室的结果证实重编程是一个缓慢的过程，外源重编程因子的表达只是最初所必需的，后来则可有可无。为了更好地调控重编程的诱导过程，两个小组构建了含有可诱导的四个重编程因子的表达载体。21,22目标成纤维细胞被可诱导载体感染，加入强力霉素（Dox）激活重编程因子的表达。通过瞬时控制重编程因子的表达，这些小组确定了重编程过程中事件发生的顺序。他们的研究表明，4因子至少必需表达8天后，iPS细胞才能独立维持多能状态。他们的研究还显示重编程的最初事件之一是起始的分化成纤维细胞特有的标志物如Thy1等表达下调。接着，不表达Thy-1的细胞子集开始表达多能性标志物SSEA-1。内源的Sox2、Nanog和Oct-3/4的上调是重编程过程中的晚期事件。Wernig等将这种方法再向前进一步，利用Dox诱导的iPS细胞产生嵌合体小鼠，23再从嵌合体小鼠的不同组织和器官中分离原代细胞，随后仅加入强力霉素，即可诱导发生第二次重编程。

由于可以分离中间群体，诱导策略将有助于更深入地了解和观察重编程机制。更好地了解这个机制反过来会促进开发更安全的iPS细胞制备方法。但是即使不需反转录病毒整合就能成功获得iPS细胞，在iPS实际应用于临床之前还是存在着问题和挑战。在分化的皮肤成纤维细胞中，一直保持沉默的那些积累的体细胞突变，在iPS细胞或它们定向分化的衍生细胞中也许不是这样。一些证据表明不同人类胚胎干细胞株在分化过程中按照其特定品系具有不同的偏向性，24 不同的iPS细胞系同样可能出现类似的情况。移植胚胎干细胞分化系时面临的畸胎瘤形成的风险同样也是iPS分化细胞担心的问题。

尽管如此，iPS细胞还是有很多可以立即实现的优势。例如，Park等最近制备了十种疾病特异的iPS系。25这些细胞系的分化所得到受特定疾病影响的细胞或组织类型，可用于生产药物筛选的细胞，或阐明疾病的病因。细胞的多能性是细胞生物学中长期存在的疑团，可能对再生医学的未来产生激动人心的结果，而iPS细胞正好为了解多能性的本质提供了一种手段。

参考文献
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