生物通独家专访：大鼠干细胞进展

多能诱导干细胞（iPS）连续两年入选《Science》年度十大科学突破，今年还被评为十大科学突破之首，其重要作用可见一斑，但是一直以来，除了小鼠和人类iPS细胞研究成果以外，其它哺乳动物iPS研究还属于空白，今日刊发的《Cell》杂志上，来自南加州大学USC应其龙教授实验小组的研究成果填补了这一缺口，为iPS技术发展又添上了华丽的一笔。就此生物通采访了国内专家钱其军教授，对这一研究的思路，以及技术发展等进行了分析，并且也给刚接触干细胞的实验人员提出了一些建议。

　　

生物通报道：多能诱导干细胞（iPS）连续两年入选《Science》年度十大科学突破，今年还被评为十大科学突破之首，其重要作用可见一斑（iPS技术解析见 iPS技术的前世今生（上），以及08《科学》十大突破最高奖：细胞程序重排技术），但是一直以来，除了小鼠和人类iPS细胞研究成果以外，其它哺乳动物iPS研究还属于空白，今日刊发的《Cell》杂志上，来自南加州大学USC应其龙教授实验小组的研究成果填补了这一缺口，为iPS技术发展又添上了华丽的一笔。

iPS成果入选生命科学十大新闻评选，欢迎来投票。

生物通对此进行了新闻报道（见后），但是有关这一技术的研究思路，为什么建立小鼠ES细胞的方法不能用在构建大鼠ES细胞？什么是3i medium？小鼠，大鼠上获得的研究成果大部分能用于人类胚胎干细胞吗？iPS技术进展真的能与核转移技术抗衡吗？国内的iPS研究水平如何？许多读者对这些问题仍然存在疑惑，就此生物通采访了国内专家钱其军教授，对这一研究的思路，以及技术发展等进行了分析，并且也给刚接触干细胞的实验人员提出了一些建议。

生物通：为什么建立小鼠ES细胞的方法不能用在构建大鼠ES细胞？

钱教授：这个问题的根源在于对ES细胞根本机制认识的缺乏。小鼠ES细胞建立的方法经历了不同的发展阶段。每次随着小鼠ES细胞建立方法的改进使人们对ES细胞机制有了更深刻的认识。小鼠ES细胞最早是由Evans MJ(2007年诺贝尔奖获得者)在1981年应用滋养层加血清建立起来, 虽然这一方法经过一系列改进, 如Austin Smith发现滋养层主要是分泌因子Lif起作用, 应其龙发现血清中主要起作用的是BMP4(Cell. 2003 Oct 31;115(3):281-92), 然而这些大多数的改进只是适用于小鼠ES细胞的特例,这种方法不适用其它哺乳类动物, 即使是小鼠, 也只适用于少数小鼠品系,在我国应用非常广泛的昆明小鼠ES细胞就一直无法用这些方法建立。直到应用应其龙最新的小鼠ES细胞建立方法(Nature. 2008 May 22;453(7194):519-23.），即3I或2I培养剂，成功建立多个品系小鼠ES细胞后，人们认识到ES细胞比较根本与普遍的性质：ES细胞在没有分化诱因的情况下处于自我更新的基础状态。后来应其龙将这种全新的培养方法应用于大鼠(Cell 2008 135, 1299–1310.)，己成功建立多个大鼠ES细胞系。我们实验室也用这种培养剂成功建立昆明小鼠ES细胞系。

生物通：在克服这一技术壁垒的过程中最初的思路是什么？如何想到了新方法？

钱教授：自鼠ES细胞被发现的25年来，人们利用各种各样的培养方法来维持ES细胞的自我复制，这些培养方法包括向培养基中加入滋养细胞、细胞因子、生长因子、激素、胎牛血清或血清抽提物等。最经典的培养方法就是利用血清和LIF共培养。人们发现，在不存在LIF或产生LIF的滋养细胞时，ES细胞即使在含有血清的培养基中也会向非神经细胞类型分化，而如果没有血清，即使存在LIF，ES细胞也会向神经细胞分化。根据这一结果，干细胞领域的传统观点认为必须存在外源细胞因子（如LIF、BMP-4等），ES细胞才能自我复制，否则ES细胞会自发分化。

    但是应其龙博士的最新研究成果表明，只需利用一些含有特定激酶的小分子化学抑制剂和无任何生长因子培养基就可很好地维持鼠ES细胞的不分化状态、自我复制能力和全能性。他利用一系列基因敲除小鼠建立的胚胎干细胞的实验发现，联合使用FGF受体酪氨酸激酶抑制剂SU5402，MEK1/2抑制剂PD184352和GSK3（glycogen synthase kinase 3）抑制剂CHIR99021等，可很好的维持ES细胞的自我复制和全能性，而不需要加入LIF和BMP或LIF和血清。应其龙博士经过多次实验还发现①Wnt/β-catenin/Tcf信号通路所激活基因的表达减少，并不减弱而是增强了ES细胞的自我复制。单独通过抑制GSK3来激活经典Wnt通路中Tcf靶基因并不能增强ES细胞的自我复制；②β-catenin介导的ES细胞之间的粘连减少并不影响ES细胞的自我复制；③在培养基中不含LIF或存在SU5402或PD184352都可抑制促进ES细胞增殖的c-myc的转录，但是CHIR99021对GSK3的抑制可以延长c-myc的半衰期，促进细胞的增殖。这是因为MEK/Erk的激活解除了Rsk对GSK3的抑制，而GSK3在蛋白水平负调c-myc。若MEK/Erk被LIFH或SU5402或PD184352抑制，则GSK3也同时被Rsk磷酸化所抑制，使GSK3不能抑制c-myc。更重要的是，他发现如果没有诱导分化的信号和因素存在，如pErk信号，鼠ES细胞的自我复制并不需要BMP/Smad 和LIF/STAT3；也证实经典的Wnt/β-catenin/Tcf信号通路对ES细胞的自我复制是不重要的，而且在一定条件下会促进ES细胞的分化。这些结果都表明，维持干细胞全能性的本质是减少诱导分化的信号或者使诱导干细胞向不同细胞分化的信号之间达到平衡，而不依赖外源生长因子和细胞因子的刺激。

   应其龙博士最新的研究成果对传统的干细胞自我复制及分化理论发出了挑战，使科学家们必须重新思考和修订传统的干细胞理论，为人们重新认识胚胎干细胞自我复制及分化的分子机制和研究肿瘤干细胞提供一种新的思维(Nature. 2008 May 22;453(7194):519-23.)。利用这一创新理论,应其龙博士在国际上首次成功建立大鼠胚胎干细胞株,这是小鼠建立胚胎干细胞株之后，在第二种动物中成功建立能在动物体内实现生殖传代胚胎干细胞株(Cell 2008 135, 1299–1310.)。人、猴, 甚至其它一些动物都似乎建立了胚胎干细胞株, 但由于没有生殖传代实验, 有些甚至也没有做过嵌合动物, 因此难以说明是真正意义胚胎干细胞株, 如目前国际上普通应用的人的胚胎干细胞株似乎更象外胚层干细胞EpiSCs(post implantation epiblast derived stem cells) (Nature. 2007 Jul 12;448(7150):196-9).

生物通：什么是3i medium？

钱教授：3I CHIR99021、PD184352及SU5402也可用2I CHIR99021和PD0325901

生物通：这种培养基（3i medium）的成分包括什么？起到了什么样的作用？

钱教授：这种培养基成份包括FGF受体酪氨酸激酶抑制剂SU5402，MEK1/2抑制剂PD184352, PD0325901和GSK3（glycogen synthase kinase 3）抑制剂CHIR99021。其中SU5402与PD184352联合使用抑制FGF/MEK/ERK信号通路，这条通路的激活使ES细胞处于基础状态，但细胞增殖很慢。CHIR99021的联合使用可抑制GSK3进而激活Wnt信号通路，促进ES细胞快速增殖而不分化。PD0325901是强效MKE/ERK抑制剂，可代替SU5402和PD184352。这些小分子抑制剂通常用于N2B27培养液（DMEM/F12/neural basal 1:1加上N2和B27）

生物通：小鼠，大鼠，人类的胚胎干细胞是否有很大的区别，从小鼠，大鼠上获得的研究成果大部分能用于人类胚胎干细胞吗？

钱教授：从目前培养条件来看，小鼠大鼠的胚胎干细胞与人胚胎干细胞存在较大差别。不论在形态学上、基因表达谱上及信号通路方面，人胚胎干细胞更类似于外胚层干细胞EpiSCs(post implantation epiblast derived stem cells)，即胚胎干细胞发育的下一个阶段。目前的人胚胎干细胞与小鼠大鼠胚胎干细胞是处于不同发育阶段的细胞，其可比性有待进一步研究，所以小鼠大鼠上获得的研究成果在人胚胎干细胞上的应用十分有限。

生物通：今年《Science》的十大科学突破之首就是iPS技术进展，这种技术真的能与核转移技术抗衡吗？这种技术最大的问题在哪里？

钱教授： iPS具有重要意义, 首次明确只要两、三个基因就可以将体细胞转化成类似胚胎干细胞了，与核转移技术相比具有巨大的优势，方法更简单，成功率更高，任何一家能做细胞培养及简单分子生物实验室就可以进行实验了，不象核转移技术需要特别仪器及专门技术。应用IPS技术可建立完全与供体细胞遗传学上相同的细胞，不像核移植技术存在异体来源线粒体基因组的干扰。因此与核移植技术相比，IPS技术有更长足的发展潜力。


    iPS这种技术最大的问题: 1）. 获得更加高效及安全的iPS转化技术, 其核心如何通过外源OCT4、Sox2蛋白高效及快速启动细胞内源性OCT4、Nanog、Sox2基因表达，最好采用蛋白转染或腺病毒载体，还需要解决外源基因是如何启动内源性OCT4、Nanog、Sox2基因表达的机制问题。2）使一个在人体上已生长很长时间体细胞使其转化成干细胞，从理论讲存在着向肿瘤方向转变可能性，因此存在着安全性问题，这需要更长时间观察。3）如何高效分化到各种有功能的细胞及组织。

生物通：国内的一些报道称国内的iPS研究水平相当高，您认为是否还是存在一定差距？具体差距在哪里？

钱教授：iPS在国际上才刚刚兴起, 在生产IPS细胞方面大家都处于同一个起跑线。国内也有不少成功培养出IPS细胞的报道，在国际上形成一定影响力。所以国内有些报道称为IPS研究水平相当高。但是IPS技术的应用与发展绝不只是局限于培养出类似于胚胎干细胞的一群细胞，它更需要结合对胚胎干细胞内在根本机制的认识与干细胞分化技术才能将其应用于再生医学。在这些转型研究（translational research）的软实力方面，国内还有很多路要走。国外也正是得益于这些干细胞相关技术的积淀实现了IPS技术的飞速发展。从综合实力上比较，美国与日本在IPS领域暂时领先。
但是近年来，随着对干细胞研究重要性的认识及政策支持力度的加强，国内干细胞研究也取得了重要的进展。要逐步缩小与国外的差距及形成较强的干细胞领域的科技竞争力还需更多的努力。

生物通：由于干细胞研究受到关注，许多实验室开始了这方面的研究，您能给初接触干细胞研究的实验人员一些建议吗？

钱教授：干细胞研究的进展不论在理论上还是在技术上都是日新月异，这对初触细胞研究的实验人员如何尽快入行形成不小的困难。如何在浩如烟海的理论著作与实验技术中找到适合自己研究的材料进行学习与分析并不是一件容易的事。

     对于初接触的实验人员可从以下几方面出发进行准备：1）必要的干细胞理论，从整体宏观的角度了解干细胞如何实现其自我更新与分化潜能，并注意如何将这些理论应用于实验设计与实验项目的构思。2）必要的实验技术，掌握如何从实际的角度探索干细胞的性质，比较根本的技术包括干细胞培养，鉴定与分化。3）从自己的实验项目出发，了解相关研究背景，应用理论合理设计，应用技术实现设计，并在其中注重理论与技术的创新。

原新闻报道：

来自南加州大学USC的研究人员历史上首次从大鼠中获得了真正的胚胎干细胞，这一突破将有利于研究人员创建更有效的动物模型，用于人类疾病的研究。这一研究成果公布在《Cell》杂志上。

领导这一研究的是南加州大学细胞与神经生物学应其龙（Qi-Long Ying）博士，其早年毕业于中国人民解放军第一军医大学，后获得上海医科大学博士学位，之后于上海医科大学，以及英国爱丁堡大学进行博后研究，现在南加州大学从事研究工作，并兼任复旦大学教授（见复旦大学人事处）。

应其龙一直以来都从事胚胎干细胞研究，曾发表多篇《Nature》，《Cell》文章，比如他曾在Nature文章中证实干细胞移植主要原因可能是细胞融合而不是分化，这是干细胞开创性进展之一，今年5月其又在Nature上发表了一篇打破胚胎干细胞传统认识的论文，文章确定了胚胎干细胞不确定分化和自我维持的新机制。这一被作者称为“干细胞自我维持基态”的发现打破了此前关于干细胞分化和培养的传统观点。

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团（Inner Cell Mass）的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞，之后密苏里的研究人员又通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。

但是当研究人员希望建立大鼠ES细胞的时候，却遇到了技术壁垒：传统用于获得小鼠胚胎干细胞的方法不能用于大鼠。为了解决这一难题，研究人员进行了系列实验 ，结果发现大鼠胚胎干细胞在存在3i medium的情况下能有效的被分离和培养——3i medium中包含了抑制三种特异性基因信号：GSK3, MEK，FGF受体激酶的分子。这种方法将干细胞与引起其分化成特异性细胞的信号分离了开来，通过阻断这些信号，研究人员就可以从大鼠中分离得到干细胞了。

至今为止还没有从除了小鼠之外的动物（包括人类在内）获得确凿可信的胚胎干细胞，这一关键技术的发展也许能帮助建立其它哺乳动物胚胎干细胞系，这对于器官移植，以及药物治疗来说意义重大。

（生物通：张迪）

附：

姓名：应其龙
职称：教授

简介：
应其龙教授八十年代毕业于中国人民解放军第一军医大学，后在上海医科大学完成了从硕士到博士后的研究工作。1999年应博士远渡重洋至英国爱丁堡大学干细胞研究所，开始了为期7年的干细胞研究工作，并在那里遇到了对他的科研生涯影响巨大的国际干细胞领域专家、英国皇家科学院院士Austin Smith教授。2006年4月来到美国南加州大学干细胞中心任助理教授，并且建立了自己的实验室，至今已两年有余。