十大创新产品候选：GS FLX 系统升级 展现全新面貌[新品推荐]

454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序的先河。之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。在已有GS 20的技术基础上，罗氏和454公司不断加大创新投入，又于2007年推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System。今年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性、读长也进一步提升。

454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。在已有GS 20的技术基础上，罗氏和454公司不断加大创新投入，又于2007年推出了性能更优的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。今年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性、读长也进一步提升。

GS FLX系统的测序原理

让我们先来了解一下GS FLX系统的测序原理。它是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。

GS FLX在进行测序时，使用了一种叫做“PicoTiterPlate”（PTP）的平板。它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。

测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

新升级让性能全面提升

新发布的Titanium系列试剂，是对现有GS FLX平台的重要升级。升级内容包含耗材、试剂和软件。你无需对仪器的硬件做任何昂贵的升级，只改进试剂和软件，就能立刻实现性能提升。升级之后，每轮测序能产生100万个读长片断，高质量（Q20）的读长增加至400 bp。第400个碱基的准确率是99%，之前的更高。通量也提高了5倍，目前每轮运行能获得4-6亿个碱基对，所需时间为10小时。
★ PTP平板的创新重设计  重新设计之后，PTP平板上孔的密度更高，利用更小的DNA捕获磁珠进行金属覆盖，改善了信号质量，因此读长的数量和长度都明显改善，同时准确性更高。目前孔的直径是29 um，DNA捕获磁珠的大小是20 um。
★ 改进的测序试剂  改进的GS FLX Titanium试剂显著降低了背景噪音，因此在几乎相同的运行时间内，读长更加长。
★ 升级的软件  优化用于超高通量测序的软件，能轻松对更大、更复杂的基因组进行拼接和作图。
★ GS FLX 2.0版  它与以前版本的输出数据也完全兼容，让片断能够共同拼接和作图。

GS FLX系统的工作流程

GS FLX系统提供了从样品制备到后续的生物信息学分析的完整解决方案。概括起来，就是“一个片断="一个磁珠" fragment = One bead = One read）

1）样品输入并片断化：GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。短的PCR产物则可以直接跳到步骤3)。

2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将在用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。

3）一个DNA片断＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片断的微反应器。

4）乳液PCR扩增：每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片断而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片断仍然结合在磁珠上。

5）一个磁珠＝一条读长：携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获。

6）数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息。GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。

GS FLX系统广阔的应用天地

作为唯一能实现序列读长超过400 bp的新一代测序技术，GS FLX系统可实现包括全部外显子和其他基因组区域的单体型分析在内的综合分析。该系统高度精确、超长序列读长促使一系列强大应用成为可能，新的样本制备工具进一步简化了这些工作。其中包括检测癌症样品中低频率体细胞突变的超深度测序，HIV感染个体的稀有变异探索，疾病相关区域外显子序列分析，通过全基因组联合分析和对16S核糖体RNA区域的鉴定来描绘出宏基因组样品中的微生物丰度和多样性。

454测序系统除了为多项研究领域开辟了基因组分析之路，同时也加速了探索的步伐。一般来说，研究、分析、撰写并提交论文，经同行评议后发表，需要一年左右的时间。而利用Genome Sequencer系统发表论文的速度，显然表明454测序结果的数据质量高，且分析简单。超长读长与易用的分析工具相结合，让研究人员能更集中精力于科学研究，而不是研究过程中的某个技术细节。这样研究项目能快速完成，接着踏上新的研究道路。

在新一代测序技术中，GS系统是最多产的。截至2008年9月，已经发表了250多篇高质量的paper。其中Nature 20篇、Science 13篇、Cell 6篇、Genome Research 20篇、PNAS 24篇。光是这些数据就让人咂舌。这些研究跨越了测序应用的多个方面：82篇全基因组测序论文包括比较基因组学的从头测序和重测序；54篇小分子RNA研究；37篇聚焦快速兴起的宏基因组学；27篇关于转录组图谱分析，包括全转录组拼接和表达图谱；13篇研究染色体结构和表观遗传学；10篇有关稀有变异检测的超深度测序这个新领域；11篇研究古老RNA。其余的文章关注454测序系统的技术和生物信息学。多种多样的应用彰显出454测序系统的能力，那些传统意义上无法用测序来解决的问题现在也一并解决了。

上个月，美国加利福尼亚大学的研究小组利用全新的GS FLX Titanium系列试剂对海洋样品的宏基因组进行测序，发现了一种全新的蓝藻物种，文章发表在11月14日的《Science》杂志上。这项研究是系统升级后发表的首篇文章。首席研究员Jonathan Zehr对于获得数据及分析结果的速度非常震惊。他表示：“多年来我们一直试图培养这种微生物，但都没有成功。有了GS FLX Titanium，我们在几天之内就通过单次测序运行，从环境样品直接获得了宝贵的基因组信息。这个系统超长的读长对于我们从复杂的微生物群体中鉴定并分析这种独特的细菌基因组来说非常关键。”

北美多个主要的基因组中心立即进行采购也是仪器性能提升的最好佐证。贝勒医学院成为第一个安装了10台GS FLX仪器的机构，圣路易斯的华盛顿大学也立刻增加至8台。麻省理工大学和哈佛大学Broad研究院目前的仪器数量也是10台。贝勒医学院人类基因组测序中心的主管Richard Gibbs教授表示：“我们很荣幸能第一个使用GS FLX Titanium试剂，也非常满意。新试剂的性能与454承诺的一样好。新的试剂有效取代了Sanger测序，因此我们正将其应用到我们中心10台GS FLX仪器上。”

贝勒医学院人类基因组测序中心的助理教授Stephen Richards博士表示, “利用454生命科学独特的3K和20K配对末端读序法，我们的N50 contig长度达到30-50 kb，N50 scaffold的大小也超过3 Mb，基因组的序列覆盖度为12倍。与对照的果蝇基因组相比，这个结果说明GS FLX Titanium系列读长至少相当于Sanger读长的8倍，而速度却快得多，费用也少了一个数量级。”

麻省理工大学和哈佛大学联合Broad研究院测序部门的主管Rob Nicol博士表示：“长达400bp的序列读长和更高的测序读长密度，新Titanium系列的改进有助于开发更高效、更高通量的工作流程，以应用于大规模测序工作中----例如人类微生物组计划（HMP）中的微生物全基因组测序。GS FLX Titanium系列的高效步骤让我们简化了工作流程，大大缩短了从样品到数据再到结果的时间。”

你也能实现新一代测序的梦想

当然，不是每个单位都能像贝勒医学院一样大手笔，购买10台GS FLX测序仪。可能光是开机运行的费用都已经让我们大呼吃不消。不过，你依然有机会实现新一代测序的梦想。最近，罗氏应用科学部携手国家人类基因组南方研究中心推出“珠联璧合，倾情回馈“的特价活动。你只需提供21 ug基因组DNA样品，并标明想要捕获的区域，他们将负责用NimbleGen的芯片捕获富集DNA，并用GS FLX进行高通量测序，最终你得到的是测序结果。费用也只是13万元，比自己测都便宜多了，而且多轻松啊，连引物设计都省了，只要分析分析，就能发很好的paper了。活动只进行到12月31日，想要测序的同学可千万不要错过了，说不定下一个发顶级杂志的就是你哦。

（生物通 余亮）