新一代的体外表达系统[新品推荐]

与其它表达系统相比，体外表达是获取蛋白的最快方法。但市场上的体外表达系统往往有一个缺陷：常常有非特异性核酸酶和蛋白酶影响蛋白质合成。此外，细胞提取物就像一个“黑匣”，许多不确定因素会改变和影响下游实验。NEB公司新一代的PURExpress体外表达系统中所有活性组份都来自于重组，避免了核酸外切酶、RNase和蛋白酶的污染，使DNA模板不被降解，表达的蛋白也不会有任何降解和修饰。

与其它表达系统相比，体外表达是获取蛋白的最快方法。从PCR或者质粒模板开始，到体外蛋白质的合成及功能检测仅需几个小时，省去了转化、转染、挑克隆等诸多繁琐的步骤，且不需要任何宿主菌，因此，特别适用于体外合成毒性蛋白及易受蛋白酶水解的蛋白质。

市场上销售的体外表达系统多是由E.coli S30、兔网织红细胞或者麦胚的提取物衍生而来。这些系统往往有一个缺陷：常常有非特异性核酸酶和蛋白酶影响蛋白质合成。此外，细胞提取物就像一个“黑匣”，许多不确定因素会改变和影响下游实验。

虽然上述这些不利因素可以通过以下方法部分克服，例如：使用经过基因工程改造的菌株、加入多种抑制剂等，但是，无论怎样，都不能从根本上解决问题。

2001年，东京大学的Takuya Ueda博士和同事首次利用重组的元件在体外合成蛋白质，除了来自E.coli的高度纯化核糖体和rRNAs外，其余组份都是重组蛋白。这就是“PURE”系统，即Protein synthesis Using Recombinant Elements的缩写，后经日本东京的Post Genome Institute (PGI)商业化。NEB公司获得了PGI的授权，并经过优化改良，开发出新一代的PURExpress体外蛋白质合成试剂盒。

PURE系统中的所有活性组份都来自于重组，避免了核酸外切酶，RNase和蛋白酶的污染，使DNA模板不被降解，表达的蛋白也不会有任何降解和修饰。转录和翻译过程仅需混合两管试剂，一步反应即可完成，省去大量实验时间，特别适合于高通量分析。

PURE系统的组分
■ 携带His-Tag的翻译因子
-起始因子（IF1、IF2、IF3）
-延伸因子（EF-Tu、EF-Ts、EF-G）
-释放因子（RF1、RF2、RF3）
-核糖体再生因子
-20种氨基酸tRNA合成酶
-甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶
■ E.coli核糖体
■ E.coli tRNAs
■ 能量再生系统
■ NTPs、氨基酸、盐、缓冲液

此外，试剂盒中应用重组T7 RNA聚合酶应用于转录和翻译。PURE系统向体外转录和翻译蛋白质迈出了重要一步，避免了细胞提取系统的“黑匣”作用。

PURE系统的优势和适用范围
PURE系统比其他体外表达系统使用更方便，合成能力更强。最为显著的优点就是去除了所有污染可能。该系统可用于表达绝大多数蛋白质，表达量超过100 μg/ml。由于翻译混合液的背景表达很低，因此，合成后的蛋白质通常不需要提纯就可以直接用于检测。PURE系统中所有蛋白因子都是重组蛋白质并且融合有His-tag，以便“反向”纯化表达的蛋白质，正是由于系统成份的高纯度，产品寿命也得到了延长，试剂盒经得起反复冻融5次，而不影响其活性。

新一代的体外表达系统应该包含有特定的组分，无背景表达，并且在高表达的同时能够对各种蛋白质进行正确折叠。PURE系统就是向此方向努力的一个典型，改进的重组系统将更适用于不同用户的要求，如：表达膜蛋白、多亚基聚合体和特殊修饰蛋白等复杂蛋白；允许合成条件的改变，如：提高或降低温度、改变离子强度和调控氧化还原环境等。

PURE系统提供了以下几个优势：
■ 无核酸内切酶和蛋白酶活性，减少了样品降解
■ 适用于环状和链型模板
■ 方便使用，混合两管试剂后加入DNA模板
■ 仅需约一小时就可完成蛋白质表达
■ 纯化的组份为翻译、分泌和折叠提供更严格的控制
■ 纯化步骤简便，转录/翻译成份可通过亲和层析去除
■ 试剂经得起多次冻融

（生物通 余亮）