miRNA图谱分析的新选择[新品推荐]

神秘的microRNA在基因表达调控中扮演着重要的角色。为了鉴定分化表达的miRNA，许多研究都以整体的miRNA表达图谱作为起始。目前进行miRNA图谱分析的主要方法是利用miRNA芯片。但其样品量大，耗时较长。在此，我们介绍一种miRNA图谱分析的新方法，既能准确定量miRNA，样品量又无需那么多。ABI公司通过对分析方法的创新改造，将TaqMan分析和实时定量PCR的特异性、灵敏度和重复性金标准引入到miRNA的检测和定量中。

（生物通专稿）microRNA（miRNA）是一类天然存在的非编码RNA，在基因调控中扮演着重要角色。它们是高度保守的单链RNA（~22个核苷酸），从更长的发夹结构前体转录本中剪切而来。到目前为止已经报道了800多个人类miRNA，还有更多的在等待实验的验证。一系列研究表明miRNA参与了许多细胞内的过程，包括发育、分化、增殖、凋亡等，那么它们自然也与癌症发育息息相关。

为了鉴定分化表达的miRNA，许多研究都以整体的miRNA表达图谱作为起始。目前进行miRNA图谱分析的主要方法之一是利用miRNA芯片，一次实验即可在整体全局角度上同时检测多个miRNA的表达情况和相互关系。

可是，事情并非如此简单。miRNA研在生理功能上如此重要，在过去却一直不为人知的原因，很大程度是由于其分子小，风度低，不稳定，种类多，同源程度高，等等。仅仅22nt左右大小的单链RNA分子，极低的丰度，纯化难度可想而知，特别是在样品量有限的情况下。由于分子小而导致难以扩增，更增加了微量样品的分析困难，特别是高通量对大量样品进行分析----几乎成为Mission Impossible----不可能完成的任务。

锁定miRNA目标的定量分析也好，miRNA芯片也好，对样品量有一定的要求----以芯片为例，通常需要1微克以上的RNA，有的甚至需要10微克。而对于只有几个-到数百个细胞的样品来说，无法扩增的情况下芯片就有些束手无策了。

在此，生物通介绍一种miRNA图谱分析的新方法，既能准确定量miRNA，样品量又无需那么多。ABI的TaqMan MicroRNA Arrays和我们常规说的芯片其实不同，这种芯片更像是TaqMan MicroRNA Assay的芯片集成形式----通过对分析方法的创新改造，将TaqMan分析和实时定量PCR的特异性、灵敏度和重复性金标准引入到miRNA的检测和定量中。

我们首先来看看TaqMan MicroRNA Assay----其实就是RT-qPCR----它利用反转录和定量PCR来定量miRNA的表达。可是，要知道，仅仅22nt的RNA短序列模板可不是一般的反转录可以做到的，其设计的巧妙创新之处在于Megaplex反转录中的引物并非随机引物，而是靶特异的茎环结构的反转录引物。这个创新设计解决了miRNA定量中的基本问题：成熟miRNA的短序列（~22nt）不允许在反转录反应中使用传统的随机引物。茎环结构提供了仅针对成熟miRNA模板的特异性，并形成引物/成熟miRNA嵌合体从miRNA的3’端开始延伸。产生的较长反转录扩增产物能作为模板，用于标准的实时定量PCR分析。就这样，miRNA就可以被扩增了----一旦扩增问题解决，样品量小，低丰度等等问题自然也迎刃而解，miRNA的定量检测和图谱分析也就有迈出了关键的第一步。

道理虽简单，但这也不是你能自己合成的引物。所以只能去ABI购买。Megaplex Primer Pools提供了Sanger MiRBase v10的综合覆盖度，覆盖人、小鼠或大鼠的667、518或303个miRNA。能满足已知miRNA图谱分析的需求。如果你的研究目标恰在其中，那么恭喜，后面的工作就相当顺理成章了。

因为有了扩增，TaqMan MicroRNA Assay就显得更加灵敏。研究人员只需要极少量的总RNA样品即可。DNA预扩增步骤的引进更显著降低了起始RNA样品量。即使1ng的总RNA，也能产生综合的表达图谱（Reference 1)。这样1个细胞也能进行分析，对临床样品而言绝对是个利好消息。而传统的方法至少需要几百纳克总RNA。

对于这种创新的扩增方法，实验表明是可靠的----TaqMan Assay的线性动态范围也很广，你可以得到多达7个对数级的线性动态范围。从几个拷贝到几百万个拷贝的microRNA靶点都可以在同一实验中准确定量。鉴于miRNA的浓度在不同的细胞、组织类型和疾病状态时差异很大，这可是一个相当关键的因素。

作为PCR和荧光定量探针TaqMan-MGB技术的权威品牌之一（Roche公司为TaqMan专利持有人），ABI开发的TaqMan-MGB产品一直被视为金标准，因此不难想象，ABI的此类产品都会不由自主的向金标准靠拢。需时三个小时得到结果。整体的miRNA图谱可以在5小时内产生，不需要几天。

有了前面的铺垫，生物通在这里进一步介绍TaqMan Assay的芯片形式-TaqMan MicroRNA Arrays。它将TaqMan MicroRNA Assays的所有优势集合并预装成便利的微流体芯片形式，特别适合人、大鼠和小鼠的图谱分析。它的原理其实很简单，就是384个定量PCR反应在一块微流量板上进行。每个阵列的内容与各自的Magaplex Primer Pools匹配，包含最多381个独特的TaqMan MicroRNA Assays，有效缩短了准备时间，并减少实验的不确定性。用Megaplex RT Primers反转录miRNA靶点及用Megaplex PreAmp Primers预扩增之后，TaqMan Universal PCR Master Mix可与每个反应简单混合，并移至TaqMan Array的八个上样口中之一，一个工作日内就能产生覆盖Sanger miRBase的综合数据集。每个物种有一套两个TaqMan MicroRNA Arrays。

不过要完成这个实验，7900定量PCR仪是必不可少的，而且还需要TLDA block才能完成。如果你附近找不到这台仪器，那你可以考虑外包。上海生物芯片中心就提供相关的服务。你只需提供RNA样品、TaqMan microRNA array，交给生物芯片公司就可以了。

目前已有多名用户享受到了TaqMan MicroRNA Assay的优势，并验证了其有效性，文章发布在《Nature》、《Cell》、《Cancer Research》等杂志上。Lee等利用TaqMan MicroRNA assay和7900HT定量PCR仪，对10种早期扩散性的鳞状细胞癌和10种 正常的鳞状上皮标本的miRNA表达进行了图谱分析，发现了70种miRNAe表达存在显著差异，其中68种上调，2种下调（2）。Si等利用TaqMan miRNA array对正常的乳腺组织和乳腺癌组织进行了miRNA的表达图谱分析。通过对5对配对样本的比较，他们miR-21在癌组织中的表达水平远远高于正常组织（3）。Resnick等则利用了TaqMan Array比较了9个卵巢癌标本和4个正常标本的miRNA表达差异，发现8个miRNA表达差异显著，其中5个上调，3个下调（4）。

参考文献：
1. Meatdagh P, Feys T, Bernard N, et al. (2008) High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 1-8 doi:10.1093/nar/gkn725

2. Lee JW, Choi CH, Choi JJ, et al. (2008). AlteredMicroRNA Expression in Cervical Carcinomas. Clin Cancer Res 14(9): 2535-2542.

3. Si ML, Zhu S, Wu H, Lu Z, Wu F, Mo YY. (2007). miR-21-mediated tumor growth. Oncogene 26: 2799-2803.

4. Resnick KE, Alder H, Hagan JP, et al. (2008). The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform. Gynecologic Oncology Availiable online.

（生物通 余亮）