南师大宛传丹等人精子蛋白表达纯化研究进展

　　

生物通综合：精子蛋白SP22与生殖功能密切相关。睾丸附睾毒物氯醇硝唑作用于大鼠生殖系统时，精子表面SP22大量脱落至附睾液中，导致生育力降低。南京师范大学生命科学院宛传丹、黄宇烽、许晓风等人，今年来深入探索了这种特殊蛋白质的的定位、克隆、表达和纯化技术。（目前QIAGEN公司正在进行Ni-NTA Superflow Cartridge 预装柱试用装免费派送活动，点击请进）

 

人精子蛋白SP22在睾丸、精子中的分布与定位

<<解剖学杂志 >>2005年06期
宛传丹 , 黄宇烽 , 汪萍

 

在该研究中，研究组的目的是要以原核表达的人精子蛋白SP22制备其兔多克隆抗体,研究人精子蛋白SP22在人睾丸和精子中的分布与定位。

 

他们采用的方法是在E. Coli中诱导表达SP22基因，以纯化出的重组人精子蛋白htSP22为抗原制备兔抗人SP22多克隆抗体，运用免疫组织化学分析SP22在人睾丸和精子中的分布与定位。

 

研究人员表达出了分子量约22 000的重组htSP22蛋白，并制备获得了能特异性识别睾丸、精子中天然SP22蛋白的兔抗人SP22多克隆抗体。免疫组织及细胞化学证明SP22存在于曲细精管中各类生精细胞及精子头部表面。

 

精子蛋白SP22研究进展

<<中华男科学杂志 >>2005年01期
宛传丹 , 黄宇烽 , 许晓风

精子蛋白SP22是一种与多种疾病相关并广泛表达于各种组织的多功能蛋白.SP22定位于精子表面,具有酶活性,能够辅助精子穿入卵子,在ras因子共同作用下具有致癌活性.各物种中SP22高度保守,说明它对生命的重要性.目前对SP22与男性不育、帕金森病的关系研究较多.本文综述了SP22在基因结构、蛋白结构、功能特性等方面的最新研究进展.

人精子蛋白SP22的cDNA克隆、表达及纯化分析

<<中国生物工程杂志 >>2004年12期
宛传丹 , 黄宇烽 , 许晓风

精子蛋白SP22与生殖功能密切相关.睾丸附睾毒物氯醇硝唑作用于大鼠生殖系统时,精子表面SP22大量脱落至附睾液中,导致生育力降低.深入研究发现SP22与生育力存在量的关系.从人睾丸组织中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出人睾丸组织中的SP22基因,连入pGEM-Teasy vector进行cDNA克隆测序.再亚克隆到pET-28a-c(+)vectors成功构建pET-28a-c(+)vectors/SP22表达载体,并转化BL21(DE3),以IPTG诱导表达,对诱导剂浓度、诱导时间进行优化后以镍离子亲和层析纯化目的蛋白.蛋白表达量占菌体总蛋白30％.所得蛋白可推动SP22的蛋白结构活性、睾丸组织中的定位分布及在男性不育、癌症等疾病检测中的应用研究.

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精子蛋白SP22在毕赤氏酵母中的表达、纯化和鉴定

<<生殖与避孕 >>2005年07期
宛传丹 , 黄宇烽 , 许晓风

目的:克隆人睾丸精子蛋白SP22基因在毕赤氏酵母中表达,并对表达产物进行纯化和鉴定.方法:RT-PCR克隆出睾丸SP22基因,导入pGEM-T克隆载体.再亚克隆到酵母真核分泌型表达载体pHIL-S1.电击转化将重组质粒pHIL-S1/SP22导入GS115酵母菌株.筛选出阳性克隆,以甲醇诱导分泌表达.镍离子亲和层析法从培养上清中纯化目的蛋白.结果:SP22编码序列与人致癌基因DJ1基本相同.重组质粒正确插入酵母基因组后,甲醇诱导SP22表达并分泌至培养上清中,表达量约占上清总蛋白的20％.纯化出的目的蛋白为糖蛋白,能被免疫印迹证实.结论:成功构建了酵母GS115/pHIL-S1/SP22重组型表达菌株,并纯化获得糖基化的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构及生理功能打下了基础.

 

抗人精子蛋白22单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

<<中华男科学杂志 >>2006年04期
王新刚 , 宛传丹 , 黄宇烽 ,

目的: 制备小鼠抗人精子蛋白SP22单克隆抗体并鉴定其特异性. 方法: 用BL/21菌表达的SP22作抗原免疫BALB/c小鼠,用有限稀释法筛选分泌SP22单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,通过ELISA技术,Western印迹方法鉴定其敏感性及特异性.免疫组化法探讨SP22在人精子表面的分布与定位. 结果: 获得3株稳定分泌SP22单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养液浓缩上清和混合腹水的效价分别为1∶ 1 000和1∶ 3 200,抗体亲和力为1.0×107L/mol,小鼠IgG亚类均为IgG1,Western印迹结果显示该抗体能特异性识别人精子SP22,免疫组化结果显示SP22主要定位于精子的顶体部位. 结论: 用杂交瘤技术制备的抗人SP22单克隆抗体具有高的效价和特异性,并且能特异地与人精子表面的SP22蛋白结合。

 

 

 

许晓风：教授，博士。1959年7月出生，1978-1982在安徽农业大学蚕学系学习；1982-1985在中国农科院研究生院学习，获硕士学位；1985-1996在安徽农业大学蚕学系历任助教、讲师、副教授，主讲现代生物学技术等课程；1996-1999在南京农业大学植保系昆虫分子生物学方向攻读博士学位，师从著名农虫专家程遐年教授，研究方向：褐飞虱对水稻的致害特性与水稻对褐飞虱数量抗性的分子作图；1998年晋升教授，1999年调至南京师范大学，承担分子生物学、遗传学（本科课）、分子遗传学和生物信息学（研究生课）的教研工作。先后主持和参加国家及省部级科研课题四项，目前在研项目四项，其中国家自然科学基金（主要参加）、省自然科学基金（主持）、国家烟草总局基金（主持）、国家烟草总局基金子项目（主持）各一项，曾获省科技进步三等奖、农业科技进步三等奖、省级优秀科技建议奖各一项，发表研究论文40余篇。

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主要研究方向：分子遗传学、生物信息学

近年来发表的有关论文 ：

1 许晓风、汪四水，遗传密码子使用频率的统计程序与实际应用，生物数学学报，1998， ( 3)： 235-241
2 许晓风，马飞等，遗传密码起源的一个新假说，自然杂志，2001，23（4）：229-231
3 Xu Xiaofeng et al, RFLP-facilitated investigation of the quantitative resistance of rice to brown planthopper ( Nilaparvata lugens), Theo. Appl. Genetics，2002, 104:248–253
4 马飞、许晓风等，相空间重构与神经网络融合预测模型及其在害虫测报中的应用，生态学报，2002，22（8）：1297-1301
5 许晓风等，褐飞虱发生的相空间线性回归预测模型，昆虫学报，2002，45（4）：548-551
6 许晓风等，水稻对褐飞虱数量抗性位点（QTL）的分子作图，安徽农业大学学报，2002，29（4）6-10
7 许晓风等，密码子与互补密码子的使用关系与生物学意义，科学通报（待发表）
8 郁锋 许晓风，耐热碱性磷酸酶功能结构域的进一步定位，中国生物化学与分子生物学报
9 郁锋 许晓风，四株耐热性下降的耐热碱性磷酸酶突变体研究，生物工程学报
19 Xu Xiaofeng, Ma Fei et al, Usage Relationship between Genetic Codons And Their Complementary Ones in Different Organisms, Computational Biology（in press）

 

黄宇烽,男，1944年11月出生。现任南京军区南京总医院全军临床医学检验中心主任，主任医师，教授，博士生导师，著名男科学专家。从20世纪80年代起从事生殖免疫学和男科学研究，在二十多年的临床实践和研究工作中，率先在国内建立了一整套全面的男女不育（孕）症实验室诊断技术，填补了国内男科诊断的空白；发明的“抑抗灵”制剂对免疫性不育（孕）治疗取得良好效果。1992年被国家人事部、总政治部批准为“国家级有突出贡献的中青年专家”，同年享受政府特殊津贴。先后获国家科技进步三等奖1项，军队、省部级科技进步二等奖6项和军队、省部级科技进步三等奖8项；1993年获南京军区科技一等奖；1995年获中国人民解放军科技重奖。2000年获国家专利1项（专利发布号：CN1263769A）。

 

主编并出版专著5本：《人类精子学》；《男科诊断学》；《男性病实验诊断手册》；《实用精液细胞学彩色图谱》；《婚恋、生育、性健康》，其中《人类精子学》获国家自然科学出版基金资助。在核心期刊上撰写学术论文100余篇。创办并主编《中华男科学》杂志（月刊），该杂志系国家科技部科技论文统计源期刊，中国科学引文数据库医学类核心期刊，并被美国Medline以及Chemistry Abstract(CA)收录，2001年入选“中国期刊方阵”，为中国新闻出版总署“双效期刊”。社会兼职：担任中国微生物学会理事、江苏省微生物学会常务理事、中华医学会男科学会委员、江苏医学会男科学会主任委员、中国免疫学会临床免疫专业委员会委员、中国免疫学会生殖免疫专业委员会委员、江苏省中西医结合学会副主任委员、江苏省免疫学会理事、解放军医学检验学会常务委员、南京军区科委会委员、南京军区检验专业委员会副主任委员、南京军区生殖医学专业委员会主任委员。南京大学医学院、第二军医大学及南京师范大学教授。《中华男科学》杂志主编、《Asian Journal of Andrology》编委、《中华国际医学杂志》编委、《南京部队医药》编委、《临床检验杂志》特约编委、《中国男科学杂志》编委、《陕西医学检验杂志》编委等。已培养博士后、博士生、硕士生10余名。
目前主要研究方向：精子发生与调控、男性不育症的诊断与治疗、生殖免疫学。

近期部分学术论文：
1. 黄宇烽, 男性不育症的实验室诊断新进展,中国男科学杂志,2002,16(4).267-272
2. 黄宇烽 王一飞，以免疫球蛋白为基础的避孕药具研究/设想，中华男科学.2000,6(1).6-10
3. 黄宇烽 杨关虎，替代睾丸活检的新方法--精液细胞学研究，男科学报.1999,5(2).81-84
4. 黄宇烽，Comparison of semen cytology & diagnostic testis biopsy in diagnosis of male infertility，J Androl,2001，22,103-104
5. 黄宇烽，精液生精细胞检查的临床意义，中国男科学杂志.1998,12(4).187-200
6. 商学军 黄宇烽，Ureaplasma urealyticum infection and apoptosis spermatogenic cells ，Asian J Androloy,1999，1(3):127
7. 戈一峰 黄宇烽，Studies on apoptosis of spermatogenic cells in normal fertile men treated with supraphysiological doses of testoste rone undecanoate Asian J Androloy,1999，1(3):155

 

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