专家解析经典蛋白纯化技术

　　

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古老的真言：经典永远不会消逝，只会随着时间越来越成熟。

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生物通报道：从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。

对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。原Amersham Biosciences的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步：

捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白；
区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；
修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。

这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。

第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。

第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。

选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionation range）。

柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。
（生物通：张迪）

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 

凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

目前常用的凝胶包括3个主要类型：
1. Polydextran

Polydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。

2. Polyacrylamide

Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH 下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH 值应尽量控制在2-10之间。

3. Agarose

商品名Separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。

凝胶和管柱的选择：

凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。

凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依据实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylamide材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。

以Sephadex为例，Sephadex G-50可用于区分分子量1,500~30,000之分子，而Sephadex G-75 凝胶可区分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,000之分子，两种都适用。

如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径＝5：1~15：1的管柱，且管柱体积要大于4~15倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高：直径＝20：1~100：1的管柱，且管柱体积要大于25~100倍的样品体积。

凝胶的处理：

商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的冲洗液中，使它充份膨胀，否则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法，即把浸于冲洗液中的凝胶加热，让它膨胀并除去气泡，温度够高的话（加温至近沸腾）也可消毒杀菌。凝胶处理过程不能剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速。

将凝胶装入管柱的方法有很多种，实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的冲洗液，边轻轻搅伴边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约1~2公分的凝胶后，打开下方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约3~5公分处停止，让3~5倍柱床体积的缓冲液流过层析柱。若用polydextran的凝胶，可放入有颜色的蛋白质（如cytochrome c）流过管柱，看看色带是否均匀下降，不均匀或出现气泡，凝胶均需倒出重新填装。

冲洗缓冲液仅需留高于柱床2 公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗液流到距表面1~2公厘，关闭出口，用滴管缓缓加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶内后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。

由于polydextran 和agarose都属于多醣类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解凝胶使其性质改变，为了防止这种情况发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能过低使凝胶冻结。加入抑菌剂（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等）也是常用的方法。长时间不用的凝胶可用干燥保存法，也就是把使用过的凝胶用水除去碎颗粒和杂质，再用不同浓度的酒精，由70%、90%到95%逐步脱水，在摄氏60~80度下烘干，不能加热的Sepharose则用乙醚洗涤干燥。

离子交换层析（ion exchange，IEX）

离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。

离子交换层析法大致分为5个步骤：

1. 离子扩散到树脂表面。

2. 离子通过树脂扩散到交换位置。

3. 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其它离子取代。

4. 被交换的离子扩散到树脂表面。

5. 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。

离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。

如果被纯化的物质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，所以当溶液的pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液pH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在约pH3~4时），随后是中性氨基酸，如glycine和alanine。碱性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达10~11时才出现。

树脂材质：

最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合产生的三维网状结构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。

根据交换树脂的性能，分为阳离子与阴离子交换树脂。

1. 阳离子交换树脂
分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 

2. 阴离子交换树脂
分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ －N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型的树脂。

除了树脂以外，纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（Sepharose）也是常用的离子交换材质，特性是具有亲水性和较大的表面积，对生物活性物质而言，是一个较为温和的环境，同时也是大分子所适用的分离纯化材质 。

实验证明，纤维材质对蛋白质和核酸的分离纯化效果相当好，因为离子交换纤维的种类多，能依据不同分离目的使用，且功能团基主要在表面，对生物大分子的交换十分有利。

离子交换剂的选择：

离子交换剂的选择，首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同pH值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱。

1. 阴阳离子交换剂的选择
若被分离物质带正电荷，例如polymyxin、 cytochrome C这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；其它像heparin、nucleic acid这类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂；如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。以胰岛素（insulin）为例，它的等电点为pH 5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用阳离子交换剂，在pH>5.3的碱性溶液中，使用阴离子交换剂。

简而言之，已知等电点的物质，在高于等电点的pH条件下，因带有负电荷，应采用阴离子交换，在低于等电点的pH下，则采用阳离子交换。未知等电点的物质，在一定pH条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附，向阴极移动较快的物质可被阳离子交换剂吸附。

2. 缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物等电点的pH值。

缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。 

离子交换树脂的前处理：

离子交换树脂使用前，先以蒸馏水除去其内之杂质 ，并以NaOH和HCl处理树脂，使其上的官能基完全露出。阴离子交换树脂先以15倍于树脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH 7.0，之后用0.5 N NaOH浸泡30~120分钟，同样以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。阳离子交换树脂用15倍于树脂量的0.5 N NaOH浸泡30~120分钟，以水清洗至pH 7.0，之后用0.5 N HCl 浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH 7.0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。

亲和层析（affinity chromatograph)

亲和层析也称为功能层析（function chromatography）、生物专一吸附（biospecific adsorption）或是选择层析（selective chromatography）。所谓的亲和力，即生物大分子和其配体（ligand）之间形成可逆结合的能力，如酵素和它的底物（substrate）、抗体和抗原、激素和受体（receptor）、RNA和其互补的DNA等，亲和层析就是根据这种亲和力发展出来的纯化方法，例如将酶的substrate接在固体支持物上，再用此支持物填装管柱，当含有这种酶的样品溶液通过管柱时，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白质及杂质不被吸附，全部从层析柱流出，最后使用适当的缓冲液，将欲分离的酶从柱中洗出来，经过这些步骤便能得到纯化的酶。

材质选择：

要进行亲和层析，ligand的选择相当重要，ligand可以是辅酶、酶的抑制剂或抗体，具备的条件如下：

1. 能与要分离的物质进行专一性的结合，亲和力愈大愈好。
2. Ligand与分子结合后，在一定的条件下又能解离，而且不会因解离破坏原本的生物活性。
3. Ligand上具有能连结到固体支持物上的团基，结合后不影响它与欲分离物质的结合专一性。

在实际操作上，若要纯化的是某一种酶，则lignad选用此酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶或是效应剂（effector ）；若是要纯化酶的抑制剂，就选用此酶作为ligand；纯化能与某维生素结合的蛋白质，可以使用这种维生素当ligand；纯化激素的受体（receptor），选用激素当ligand。纯化核酸可利用核酸与蛋白质的交互作用、DNA之间的互补关系、DNA与RNA的hybridization，运用适当的ligand。

亲和层析中与ligand连接的支持物多为凝胶，凝胶应具备以下条件：

1. 不溶于水，但具有亲水性，如此ligand才容易接近水溶液中的欲分离物。
2. 化学惰性，没有（或极少）离子交换这一类非专一性的结合。
3. 具有足够的化学团基，经活化后能与大量的ligand结合。
4. 最好是均一的球状颗粒，制成的管柱才能有较佳的流速。
5. 具有多孔网状结构，方便大分子自由通过。
6. 物理及化学性质稳定，不因洗出时改变的各种pH值、离子浓度、温度或界面活性剂而改变其结构。

亲和层析法使用的支持物种类，部份与胶体过滤法重复，除了Polydextran、Polyacrylamide、Agarose以外，Ultrogel是能承受较大压力的凝胶，流速高；cellulose 主要用于亲和免疫层析，但它有非专一性吸附的性质；Bio-glass是硼硅酸钠经高温和酸碱处理制成的多孔玻璃，质地硬、强度高、孔径均匀、不怕微生物侵袭，但缺点和cellulose一样，它的表面对蛋白质也有非专一性吸附。

样品的分离：

要使要分离的物质与ligand分离，通常采用改变pH、离子浓度或缓冲液的组成，使其亲和力降低，有时使用0.1M醋酸或0.1M 氢氧化钠冲洗，就能得到不错的效果。如果纯化对象与ligand的亲和力不强，当连续通过大量的平衡缓冲液，就能在杂质洗出后，得到所要的物质；若亲和力较强，则要使用较强的酸或碱作为冲洗液，或是添加guanidine hydrochloride，但这些溶液容易使纯化对象失去生物活性；用较高浓度的ligand溶液亦可将管柱上所吸附的物质洗出，此ligand可以与管柱上的相同或相异。

对于亲和力小的物质，上柱的样品最好是体积小而浓度高，粘度较大的溶液，可以将一定量的ligand加到待分离的溶液中，搅拌平衡一段时间，进行过滤或离心，最后进行洗出的步骤。由于生物大分子和其ligand间达到反应平衡的速度很慢，样品上柱的流速要尽量慢；通常亲和力会随温度增高而降低，其中一例是将乳酸脱氢酶从管柱上的AMP洗下来时，所需的NADH浓度随温度增高而减少，在摄氏零度到十度间的变化尤其明显，因此如果待分离的物质在摄氏4度可被紧密吸附，在摄氏25度以上容易被洗下来，则可在4度环境下进行亲和吸附，在25度以上的环境进行洗出的步骤。