定量PCR 选择二：荧光探针与荧光引物[选购宝典]

    [生物通定量PCR技术专题] 我们前面比较详细地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品，显然，作为定量PCR的初期阶段的荧光染料法还是有局限性的，比如，由于染料不能区分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探针，所以检测的特异性始终不如后来出现的探针法；需要在PCR后进行熔链曲线分析；也不能做多重PCR检测（Multiplex）。

    上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。

    要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。

    实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

一：水解探针法

TaqMan技术

原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（通常20—30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高

MGB技术

原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针——MGB探针（minor groove binder oligodeoxynucleotide conjugate, MGB-ODN)，3'端采用了非荧光性的淬灭基因——淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽( dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)， 可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm 值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm 值——而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高： 一个15bp的MGB 探针的信噪比大于6,优于理想状态下的25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。有实验证明MGB探针对于等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱基突变(因为碱基错配对较短探针的杂交稳定性影响更大) 。

    水解探针之所以称之为水解，主要是因为它利用的是Taq酶的水解作用，使得探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发光信号，游离的报告基团数目对应PCR新扩增产物，此方法检测的是积累荧光。

优点：

1. 灵敏，特异性高：具有模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的定量PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。

2. 有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性

3. 避免了荧光染料对PCR反应的影响     

缺点：探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高

    此外，也有人认为，Taqman法利用了Taq酶的外切活性，而由于各家公司出产的Taq酶对于其外切酶活性并没有做出严格的活性标定，定量PCR的效率有可能受酶外切活性的影响，酶活性差异也给定量带来了不确定性。至少，生物通定量PCR技术系列前面介绍的Stratagene 2100万美元专利之争的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqman探针法了！

应用：Taqman技术广泛应用在人类传染病诊断和病原定量上，在动物疾病病原体基因的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定以及在疫苗效力测定上等方面都有成功的许多例子。

注意：1) 探针长度应在15-45bp（最佳20-30bp)左右，以保证结合的特异性。2) GC碱基含量在40%-60% ，避免单核苷酸序列的重复。3)避免与引物发生杂交或重叠。 4)探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的Tm值要比引物的Tm 值至少高出5℃。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。另外，在仪器的选择上也要注意，尽量选择具有4色或以上的荧光检测通道的仪器，已保证你的机器的适用性和试剂选择的灵活性。毕竟技术是在快速发展的。　

二：杂交探针法

FRET技术

原理：罗氏专利的FRET探针又称为双杂交探针，或者LightCycle探针。FRET探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离1—5bp），上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5`端标记Red 640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻（距离1—5bp），激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和SNP检测。常用的受体荧光基团除了LC-Red640还有LC-Red705。 两个单标记探针的长短不影响信号的传递，而探针间的距离通常为1-5bp（虽然越短越好，还是要留点空间避免相互之间的反应）。

    我们前面提到，Taqman水解探针法中，一但报告基团水解离开淬灭基团，就一直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近而产生检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆的，所以可以进行熔解曲线的分析，还可以用于进行突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别。比如一旦探针位置上出现有点突变，通过熔解曲线就可以很快分析出来，这也是Taqman法无法做到的。另外，由于采用2条模版特异的探针，杂交探针法的专一性无疑更高于其他方法，不受非特异产物的影响。

    Fret探针法由于需要合成2条探针，探针的末端要封闭以避免反应，所以合成的成本会比较高，也比较麻烦。但实际上，Fret探针的设计其实比Taqman探针容易，因为Taqman探针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模版的能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离远而使得荧光共振能量传递的效率降低，淬灭不彻底。Fret探针就不受这个限制。不管怎么说，多数人还是习惯认为单探针比合成2条探针要简单。 

    在水解和杂交探针技术之间产生另外一种技术：分子信标（分子信标产生时间是1996年）

分子信标技术

原理：分子信标（ Molecular beacon，MB）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。  分子信标的茎环结构中，环一般为15-30bp（有人认为18-20个bp较好）长，并与目标序列互补，茎一般5-7bp长（GC含量较高），相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激发光子。 应用：应用于基因定量分析和突变体识别、疾病基因检测与诊断、单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物医学基础和临床研究中。 优点：本底低，特异灵敏 缺点：①杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差。       ② 探针合成时标记较复杂 延伸技术：建立在分子信标技术基础上的探针技术有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion等，其中 Sunrise技术，这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧光信号响应快，但无法区分特异和非特异扩增是其致命的不足。 Amplisensor技术是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。两探针长度不同，其中淬灭物标记探针5’端多出7个碱基（GCGTCCC）。PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR引物的5’末端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针－引物复合物作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了FRET，而产生荧光。 Scorpion技术（蝎形引物）则是通过在分子信标的3’端设计连接臂连接一段引物，使PCR延伸反应时不能够延伸至分子信标，这样非特异扩增产物便无荧光信号。包含发夹结构的PCR产物在退火时形成分子内杂交，发夹结构被破坏，两个基团之间发生荧光共振能量转移，从而发出荧光。这种方法可以解决非特异的问题，同时灵敏度高，反应快，已应用于k-ras及BRAC2基因的突变分析了，但这种方法不能保证杂交时探针与模板完全匹配，而且合成复杂。

这种技术虽然也是积累荧光（因为结合上模板以后不会掉下来），但是不同于Taqman水解探针，分子信标可以进行溶解曲线分析，这也就是说分子信标可以进行包括突变检测，SNP检测等在内的定量PCR延伸应用。但是这种技术正如上面提到的探针设计复杂，稳定性差——而这一点对于溶解曲线的影响颇大，因此在应用上也需要审慎考虑。 　

第三代：荧光引物

Amplifluor技术	原理：激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性Amplifluor引物包含一个5’内部互补序列，标记有荧光发色团（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3’端序列是目标特异性引物区。未结合的Amplifluor引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。 在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在第二个循环中 Amplifluor引物1延伸产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。
LUX技术	原理：LUM(light upon extention) 引物技术是Invitrogen公司的一项专利，是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。使用类似分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用LUX引物，不需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性，因此他的特异性要弱于探针技术，但非特异性扩增或引物二聚体没有影响，所以其特异性要强于SYBR　GREEN。

	SYBR　GREEN	FRET探针	Taqman	分子信标	LUX 引物
性质	可逆荧光		积累荧光
熔点分析	能		不能
特异性	引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）	引物＋2探针	引物＋探针	引物＋探针	引物（非特异性扩增或引物二聚体无影响）
探针	不需要	需要	需要	需要	不需要
通用性	通用	专用	专用	专用	专用

    看完这些方法，相信新近接触定量PCR的人就已经觉得眼花缭乱了，其实虽然以上这些检测技术有许多，但是实际上在商品成熟应用上并不是有这么多丰富的选择，具体的优良产品筛选请见：

定量PCR经典之选——Taqman探针

定量检测精灵——荧光引物

中国的PCR——达安

（生物通：张迪）