谁是测序技术大玩家？

　　

生物通报道：DNA测序方法起始于英国生物化学家桑格（F. Sanger）在1975年建立的“加减法”，之后美国生物化学家马利斯（K.B. Mullis）发明了聚合酶链反应PCR技术，被迅速的应用于测序，大大的提高了测序的速度。经过30年的发展，DNA测序由半自动化发展到全部仪器自动测序，但基本的原理仍然没有完全跳出Sanger测序方法，然而随着去年454公司推出了比Sanger测序方法快100倍的新型测序仪，有开发商置疑Sanger测序方法是否已经过时了？

 

 

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4月28日PNAS公布了美加州大学旧金山分校和伯克利分校的一项新型技术：100mmDNA测序仪。这个测序仪整合了Sanger测序的三个步骤：扩增反应、样品制备和纯化以及毛细管电泳分离，通过将这三个完全不同的过程整合到一张直径为100mm的微型圆盘上，缩小了尺寸，便于携带，也意味着这个测序仪只需要少量的测序试剂（250μl的反应体积用1x10-15mol（飞摩尔）的DNA模板量）就可以完成测序过程——而测序试剂的昂贵性正是目前阻碍测序进行的一个重要方面。

虽然尺寸小，但这个仪器并没有失去原有Sanger技术的高精确度的优点，研究者认为这种仪器可以和任何一台典型的Sanger测序平台媲美。目前利用这种仪器，加州大学的研究人员已经以99%的准确性通读556bp的序列——454公司（罗氏）推出的焦磷酸测序法的测序长度据称是400bp。

这个“麻雀虽小，五脏俱全”的仪器之所以能够保证将Sanger复杂的三步反应整合到一个小小的圆盘中，并且保证不影响反应的进行主要是依靠一种新型的PDMS（聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane)材料：这种能调控水合作用，通透性极好的材料在近期的蛋白结晶结构分析中也起到了重要作用。将PDMS和玻璃混合（hybrid glass–polydimethylsiloxane）组成一种微型结构，即将微阀形式（microvalve-forming）PDMS膜加在多层玻璃晶片结构上，组成了一种前所未有的复杂整合，功能强大的微组装系统（microfabricated systems）——这一技术实际上2004年Lagally就发明了。

除此之外，研究人员还表示将改进注入毛细管的样品量，这样保守估计，可以再降低模板和反应体积10倍，意味着与目前运用Sanger测序技术的测序中心相比，新技术可以降低800倍的模板用量和400倍的试剂用量。而且如果进一步改进扫描的灵敏度，研究者就可以使DNA模板的用量少至10 attomoles——一旦模板的用量进入attomole水平，就意味着针对传统的Sanger测序法的另一个改进成为可能：可以不用克隆库，而改用PCR克隆，或者聚合酶克隆（polonies），或者单个分子的pcr反应产物。而且既然该仪器整合了所有测序的步骤，工作人员就可以减少，这也是另一个目前不易量化的带来成本降低的因素。

另外在速度方面，虽然目前无法像454技术一样获得加快100倍的测序速度，但是研究者表示由于需要的起始量很少，因此可以考虑像454技术一样，不用克隆库的方法，转而用磁珠扩增的方法，这样就会大大的加快反应的速度，成为原Sanger方法和454技术的优点集合体。

难怪这个仪器一经发明出来就被表示要用于火星探索生命迹象，目前MBI公司已经将一台仪器送到哥伦比亚大学实验室的合作者Jingyue Ju进行测试，同时MBI也表示将预备在2008年加入磁珠扩增系统，完成这一仪器的集成。其实MBI也并不是目前唯一试图改进和小型化Sange测序仪的集团——位于Woburn, Mass的Network Biosystems公司去年得到了450万美元的NHGRI经费开发一种微组装Sange测序仪，SUNY Stony Brook的研究者Vera Gorfinkel去年也获得了150万美元NHGRI进行二维的可以运用微升的反应体积进行monolith multi-capillary arrays的开发。（生物通：张迪）