定量PCR技术之2100万美元的专利之争：Stratagene定量PCR系列[新品推荐]

    在生物通前面的定量PCR技术报道系列中，介绍过DNA聚合酶对于定量PCR反应保持特异性的重要作用，Qiagen和ABI采用化学修饰Taq酶得到高度严谨的热启动Taq，从而有效减少了非特异扩增，提高荧光染料法做定量PCR的特异性。而以PCR高保真酶著称的Stratagene公司的策略之一是选择了另外一种DNA聚合酶完成PCR扩增反应，并通过两个作用强大的蛋白因子保证反应过程的特异性，从而组成了一种独一无二的高速高效高特异的定量PCR荧光染料试剂——FullVelocity™ SYBR® Green QPCR & QRT-PCR Reagents。有心的读者大概还记得过去2年中，生物通网站系列报道了围绕着PCR专利发生的一系列诉讼，其中最引人瞩目的是MJ公司侵权被判罚1980万美金而破产，最后被BioRad超低价收购的事件——MJ卖了那么多年的侵权PCR仪，被ABI和Roche联手告倒才判罚不到2000万美元，而去有关FullVelocity的专利纷争的赔偿金额竟然达到了2千1百万美元，到底这个技术为什么值这个价钱呢？

1. 快速：这种非Taq DNA聚合酶是一种古细菌DNA聚合酶（archaeal DNA polymerase），技术人员将其与DNA结合的结合位点进行了改造，得到了一种相比一般Taq酶和其它已知的DNA聚合酶，扩增速度大幅度提高的聚合酶。利用这种酶进行PCR反应，40个Cycle的反应可以缩短40%左右的时间，仅仅需要不到1个小时！（不同的仪器不同，见下表），难怪这种技术被命名为“full velocity”PCR——全速PCR。（要是你的实验室只有旧款的老定量PCR仪，每次都要折腾2个小时才能做一轮实验，平时只能羡慕人家Roche、Corbett、Cepheid定量PCR仪只要30—40分钟的超快反应，那选择FullVelocity就可以帮你提速，让你在老式机上一小时内完成实验哦。）
   

2. 高特异性和灵敏性：FullVelocity DNA Polymerase虽然反应迅速，但这主要是依靠这种特殊的酶在退火/延伸过程中的活性，并不会影响到PCR的产量以及特异性。以QRT-PCR为例，这个酶可以在3pg—3ug的total RNA模版的条件下保持良好的线性结果，特异性和灵敏度相当高

3. 温度变化耐受性强：FullVelocity的DNA聚合酶比普通Taq酶更好的适应快速的温度变化条件，耐受性更强，因此更好适用于一些反应温度变化快的仪器

4. 比Taq酶更有效利用dUTP，对利用dUTP消除非特异污染更有利

5. 降低SYBR Green 的抑制作用：已知SYBR Green对Taq酶扩增有一定的抑制作用，而经过改造的Fullvelocity DNA聚合酶去掉了3´-5´ 和5´-3´ 核酸酶活性和一个DNA结合位点，有效降低DNA聚合酶受SYBR Green的影响，因而扩增更有效率

6. 

    另外Fullvelocity还有一个保持SYBR荧光定量特异性的法宝，那就是两个特异增强因子：thermostable accessory protein和结合在FullVelocity DNA polymerase上的单克隆抗体。前者可以导致每一个循环中的错配引物-模板不稳定，从而减少非特异性扩增的发生几率。后者则可以确保在反应温度达到DNA变性之前不会发生扩增反应，这主要是通过抗FullVelocity DNA polymerase的抗体结合在聚合酶上，封闭其活性位点，当温度升至95℃时，抗体失活，释放DNA聚合酶，进行PCR反应。

二、Brilliant系列

    除了这个价值2100万美元的Fullvelocity， 以产品性能稳定可靠而成为美国冷泉港实验室培训课程的指定供应商的Stratagene还有一个Brilliant定量PCR系列，这个系列同样引用了经过化学修饰版本的HotStart Taq酶，使得需要在92—95度间热启动10分钟，酶活性才释放出来，从而避免了低温下非特异性扩增。从生物通介绍的这几大著名产品供应商纷纷推出严谨的95度高温处理热启动Taq酶，你也能推测出严格的热启动对于定量PCR是多么重要吧。

    Brilliant试剂盒检测范围宽，极为灵敏。标准曲线显示在3-3×10¹⁰拷贝范围数据稳定可靠。完备的试剂盒设计兼顾灵活性和检测性能最优化——核心试剂盒方便进行精确参数调整，而预混试剂盒经优化，直接用于大多数实验，极其方便。Brilliant试剂盒与多数厂商提供的QPCR仪兼容，带有包括内参的完整试剂。包括Stratagene的Mx™系统，以及ABI，MJ，BioRad，Corbett Rotorgene等品牌QPCR仪器。生物通特别推荐的是6月底前Brilliant系列有5折至55折大幅度优惠，部分产品国内现货，Brilliant® SYBR® Green QPCR预混试剂盒2个以上优惠价RMB3463/kit，200rxn，差不多最实惠的价格了，要买趁早。 

    除了性能稳定可靠，能得到满意的结果，Brilliant系列还有一个很方便而且有趣的产品：Brilliant® SYBR® Green SideStep™ QPCR Master Mix。做定量PCR通常要经过一系列核酸纯化的步骤，这个 SideStep就是让你可以省略核酸纯化步骤，从哺乳动物细胞直接做定量PCR。这样做大量样品时就非常轻松简单了——收集培养细胞，用试剂盒提供的裂解液释放并稳定核酸——裂解液处理得到的核酸样品可以稳定半年之久——然后就可以进行定量PCR或者是QRT-PCR等检测了——既能节省核酸纯化的费用，又快速方便好用。（生物通）

特别的“染料”给特别的你：Invitrogen独家的SYBR GreenER

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