Sanger技术的里程碑:100毫米DNA测序仪[创新技巧]

    美国和英国科学家18日在英国《自然》杂志网络版上发表了人类最后一个染色体——1号染色体的基因测序，解读人体基因密码的“生命之书”宣告完成。“公布人类最后也是最大一个染色体的测序为人类基因组计划画上了句号，标志着建立在人类基因测序基础上的生物学和医学研究掀起高潮”。整个人类基因组计划的伟大工程正是建立在我们熟悉的Sanger测序技术的基础上。测序不仅对于未完成的各种生物体测序，还是疾病诊断治疗仍然具有重要的意义，因此相应的测序技术也在不断的发展。

    去年8月Nature杂志的一篇文章打破了自2000年就呈现停滞状态的测序技术，来自454公司的研究人员公布了他们开发的比Sanger方法快100倍的一种技术（见快速基因组测序时代到来和新技术：测序如何加快100倍的）。这一技术实际上也就是Biotage最早应用到商业化的焦磷酸测序技术（即利用dNTP结合的过程会释放焦磷酸盐,焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光，见技术及其在DNA测序和SNP研究中的应用），这个过程无需进行电泳，因此大大的加快了速度。而454公司在此基础上利用自动化又加快了测序的速度：整个过程从最初的DNA片段扩增到测序，全部都是采用微流技术（micorfluidic technologies），而且可以同时分析数以千计的DNA分子。因此454公司宣传利用这种技术，100天我们就可以测出人类基因组了。

    但是随后，美国能源部联合基因组研究所却表示这一技术并不完善，这主要是因为454技术反应迅速的重要原因之一就是不需要任何克隆，但是这也造成了这一技术的一些缺陷：无克隆反应导致无法获得材料来覆盖序列缺口，而且在基因组测序完成过程中的一个重要部分就是补充低丰度区域。而且对于像癌症这样的疾病中，检测结构基因组的变异，包括重复序列，基因倒置，删减，和复制都是非常重要的。

    这样看来这两种方法都有各自的优点和缺点，那么有没有一种能集合Sanger测序法的高精确度和焦磷酸测序法的迅速这两个优点的测序方法呢？

    4月28日PNAS公布了美加州大学旧金山分校和伯克利分校的一项新型技术：100mmDNA测序仪。这个测序仪整合了Sanger测序的三个步骤：扩增反应、样品制备和纯化以及毛细管电泳分离，通过将这三个完全不同的过程整合到一张直径为100mm的微型圆盘上，缩小了尺寸，便于携带，也意味着这个测序仪只需要少量的测序试剂（250μl的反应体积用1x10^-15mol（飞摩尔）的DNA模板量）就可以完成测序过程——而测序试剂的昂贵性正是目前阻碍测序进行的一个重要方面。

    虽然尺寸小，但这个仪器并没有失去原有Sanger技术的高精确度的优点，研究者认为这种仪器可以和任何一台典型的Sanger测序平台媲美。目前利用这种仪器，加州大学的研究人员已经以99%的准确性通读556bp的序列——454公司（罗氏）推出的焦磷酸测序法的测序长度据称是400bp。

    这个“麻雀虽小，五脏俱全”的仪器之所以能够保证将Sanger复杂的三步反应整合到一个小小的圆盘中，并且保证不影响反应的进行主要是依靠一种新型的PDMS（聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane)材料：这种能调控水合作用，通透性极好的材料在近期的蛋白结晶结构分析中也起到了重要作用。将PDMS和玻璃混合（hybrid glass–polydimethylsiloxane）组成一种微型结构，即将微阀形式（microvalve-forming）PDMS膜加在多层玻璃晶片结构上，组成了一种前所未有的复杂整合，功能强大的微组装系统（microfabricated systems）（见下图B）——这一技术实际上2004年Lagally就发明了。

    在这种系统的基础上，（见下图A）将两个扩增反应器，纯化和浓缩装置，CE Channels（capillary electrophoresis，毛细管电泳道，黑色），RTDs（二极管，红色），microvalve/pump（绿色），通透增强道（pneumatic manifold channel，蓝色）和表面加热器（橘色）整合在一张直径为100mm的圆盘上。

    这样不同于之前Sanger方法——重复性只是依赖于电泳控制，而这个过程中测序样品在特定通道的运动缓慢，因此不可靠——新技术将电泳，气动装置（pneumatic），热循环样品控制整合在一起就能够有效的进行有效的少量样品反应，其中的一个关键点就是从一个单集成电路结构（monolithic substrate）到PDMS-glass复合体（通透性强）的转换。多层结构允许更大的设计复杂性空间，以及一种对于scaling feature density和parallel processing都很重要的技术优势，而且这种双层复合结构也保护了用于DNA分离样品单个碱基分辨率的所有玻璃结构。

    除此之外，研究人员还表示将改进注入毛细管的样品量，这样保守估计，可以再降低模板和反应体积10倍，意味着与目前运用Sanger测序技术的测序中心相比，新技术可以降低800倍的模板用量和400倍的试剂用量。而且如果进一步改进扫描的灵敏度，研究者就可以使DNA模板的用量少至10 attomoles——一旦模板的用量进入attomole水平，就意味着针对传统的Sanger测序法的另一个改进成为可能：可以不用克隆库，而改用PCR克隆，或者聚合酶克隆（polonies），或者单个分子的pcr反应产物。而且既然该仪器整合了所有测序的步骤，工作人员就可以减少，这也是另一个目前不易量化的带来成本降低的因素。

    另外在速度方面，虽然目前无法像454技术一样获得加快100倍的测序速度，但是研究者表示由于需要的起始量很少，因此可以考虑像454技术一样，不用克隆库的方法，转而用磁珠扩增的方法，这样就会大大的加快反应的速度，成为原Sanger方法和454技术的优点集合体。

    难怪这个仪器一经发明出来就被表示要用于火星探索生命迹象，目前MBI公司已经将一台仪器送到哥伦比亚大学实验室的合作者Jingyue Ju进行测试，同时MBI也表示将预备在2008年加入磁珠扩增系统，完成这一仪器的集成。其实MBI也并不是目前唯一试图改进和小型化Sange测序仪的集团——位于Woburn, Mass的Network Biosystems公司去年得到了450万美元的NHGRI经费开发一种微组装Sange测序仪，SUNY Stony Brook的研究者Vera Gorfinkel去年也获得了150万美元NHGRI进行二维的可以运用微升的反应体积进行monolith multi-capillary arrays的开发。（生物通：张迪）