-
生物通官微
陪你抓住生命科技
跳动的脉搏
“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen VS ABI（III）[选购宝典]
【字体： 大 中 小 】 时间：2006年05月18日 来源：生物通
编辑推荐：
（续前）
 定量PCR技术报告之三:“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen VS ABI（I） |
二、ABI 的金字招牌
说实话，这种化学修饰的、需要在95度激活的最严谨的热启动Taq酶，并非由Qiagen原创，而是PCR专利持有人之一，生命科学领域仪器供应商收入排行榜亚军——ABI（美国应用生物系统公司）最早推向市场的。话说当年Mullis发明PCR技术后，Roche以30亿美元的天价收购了Mullis所在的Cetus公司以及PCR专利，可是当时Cetus还和当时的Perkin Elmers公司合作开发PCR仪器，所以部分PCR专利依然被坚持牢牢控制在PE公司手里——直到PE收购ABI，最后不知怎的，PE其他部分又被分拆出售，ABI控制了这无价之宝的PCR专利——至今每年依然坐享估计超过5千万美元的专利使用费，即使为此要花费上千万美元的官司费用也在所不惜。言归正传，ABI对PCR技术的发展和推广作出了不可磨灭的贡献，特别是在定量PCR领域，ABI率先推出的Taqman探针法亦成为定量PCR的标准方法之一。正是因为这种霸主地位，ABI的PCR仪和PCR试剂亦成为追求品质和稳定性的用户的首选。自然而然，选择ABI的仪器就希望能够配套的使用到ABI的定量试剂。
ABI的SYBR荧光染料定量PCR试剂盒主要包括两种：SYBR® Green PCR Core Reagents和SYBR® Green PCR Master Mix（主要区别在于前者包括AmpErase® UNG），其中SYBR Green的染料其实各个厂家都差不多——据称ABI的SYBR Green就是从Molecular Probes买来稀释的，而真正值得注意是在ABI的“金牌”酶：AmpliTaq Gold® DNA Polymerase——特别是若干年前国人的金牌情结，ABI就光凭这个名字曾经打动多少人的心，名字起的确实不错。
AmpliTaq Gold并不只是名字起的好听，也确确实实是ABI定量PCR试剂中的一块金字招牌。正如前文提到的要解决SYBR Green的非特异性瓶颈问题，DNA热启动聚合酶是最好的选择之一，AmpliTaq Gold也许是第一个真正意义上的Hot Start——即通过对Taq酶的修饰确保在95℃才激活，根本上防止了反应前非特异性扩增。AmpliTaq Gold对Thermus aquaticus Taq DNA polymerase进行化学修饰改造（Qiagen的HotStarTaq也进行了相似的改造）——通过这种改造，修饰成份可以封闭AmpliTaq活性位点，在95℃之后，这种修饰成份也就从AmpliTaq上释放出来，还原AmpliTaq扩增活性。这样就确保了DNA在完全解链的情况下才会开始PCR扩增反应。这种利用大肠杆菌重组表达获得的分子量为94KD的重组Taq酶，高纯度（ultra-pure），无gelatin干扰，有良好的耐热性，强扩增力，以及重复性。比较于Qiagen的相对应的产品，ABI的AmpliTaq Gold所需的激活时间较短（5分钟左右，和Qiagen HotStarTaq Plus相当），扩增的片段可以达到5Kb。
另外在ABI的SYBRGreen 试剂盒中还有一样东西是ABI特有的，那就是AmpErase UNG。定量实验对于准确性的要求是普通PCR无法比拟的，但在实际操作中PCR反应可能产生各种各样的扩增，为了防止非目的片段的扩增就必需首先确保没有污染。污染的来源主要有两种，第一种是操作过程中模板，试剂或者器皿导致的，另外一种就是扩增子交叉转移（amplicon carryover）。前者可以通过严格的实验室控制来避免，而对于后者这种内生性的污染，科学家们设计了一种有效方法，即尿苷酶(Uracil-N-Glycosylase，UNG)法，也称为尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）法，这种酶可以移除DNA中的尿嘧啶，在扩增过程中将dTTP替换为dUTP使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来——因为前面的扩增产物对UNG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UNG处理以破坏非特异扩增产物。
ROX荧光染料对照也是ABI系的定量PCR仪所必需的，为了平衡96板中管间的差异，需要ROX作为对照进行平衡，否则难以得到正确的溶解曲线而变成波浪线。所以，你可以看到，虽然96孔板仪器设计上有固有的偏差，但是ABI总是能提供校正方法以保证实验结果的严谨的。毕竟是大腕啊。（生物通原创，谢绝转载）
