“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen vs.ABI(II)[选购宝典]

 （续前）

定量PCR新技术报告之一：UPL

定量PCR新技术报告之二：更准确、更安全的GeneXpert定量PCR一体机

定量PCR技术报告之三：如何选择荧光定量检测技术(I)之SYBR Green

定量PCR技术报告之三:“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen vs ABI(I) 

Qiagen的酶学策略

    除了引物，Qiagen的QuantiTect SYBY Green PCR（还有RT-PCR试剂盒）的解决方案就首先从酶下手。Qiagen的HotStarTaq DNA Polymerase最初是从Thermus aquaticus中分离得到的一种分子量为94kD的Taq酶，经过修饰的这种酶在常温下活性被封闭，需要95℃激活15分钟后才恢复有聚合酶的活性，这就从聚合酶本身避免了由于起始循环温度较低形成非特异性错配PCR扩增，大大提高了PCR反应的特异性及灵敏度，而且可以避免由于加入单抗或者蜡等引起污染。对于单管内进行多重PCR扩增（MultiPlex）来说这个特性格外重要——单管内扩增多个目标基因，要是再加上非特异条带那不全乱套了吗？！非要热启动不可！

    对于定量RT-PCR，由于首先要进行RT反应，再进行PCR反应，Taq酶的“瞎忙”错误影响更为严重。Qiagen的精确设计使得这种酶在对RNA进行的逆转录反应过程中“保持沉默”，保证不会影响到逆转录酶的活性，即使在单管一步法中也能确保两个反应互不干扰地进行。QuantiTect SYBR Green RT-PCR的优势不仅限于最严谨的HotStart功能有效防止达到变性温度其前的非特异扩增，更值得一提的是Qiagen的RT酶是两种RT酶的混合，Omniscript保证高产量，Sensiscript保证高灵敏度达到pg级，无需优化即可使用，值得推荐－－除了价格。

从酶的源头上避免了非特异产物出现，Qiagen还同时在缓冲体系上下功夫，想方设法减少模版二级结构和引物二聚体、错配的出现。熟悉Qiagen的PCR系列的实验人员一定会对 Q-Solution留下深刻印象。而QuantiTect SYBY Green PCR系列的缓冲液还更优于Q buffer，这个独特缓冲体系包含有Tris·Cl, KCl, (NH4)2SO4，以及5mM MgCl2。在退火的过程中，KCl和(NH4)2SO4的比例介入提升引物与模板结合的特异性，这主要是因为K+结合在双链DNA磷酸集团上保证引物退火稳定，而NH4+则可以使得错配碱基之间作用力较弱的氢键容易断裂，确保特异性扩增。     这种特异性的保证经过了实验验证，在右上图中第一道就是Qiagen的HotStarTaq，其后分别是其它DNA聚合酶以及抗体介导的热启动PCR扩增，通过对一个长度为497bp的片段扩增比较，可以明显的看出Qiagen的HotStarTaq的特异性优势。     Mg+浓度已经优化，上手就可以做好，特别适合初始接触定量PCR的实验人员。

    除了特殊的DNA聚合酶，独一无二的PCR Buffer之外，QuantiTect SYBR Green的预混合试剂不单方便使用，并已经优化条件，在SYBR试剂中同样预混了dUTP代替部分的dTTP，允许采用尿苷酶(Uracil-N-Glycosylase，UNG)来防止非特异性PCR扩增和污染（在试剂盒中不提供，如果需要另外购买）。UNG酶在50°C激活，95°C灭活，可以降解含有dU的双链或单链DNA。在第一轮PCR循环前50℃保温，直到95℃被灭活，UNG可以降解含有dUTP的DNA片段——也就是95度变性前合成的可能有错误的片断，而原来的模版不受影响。这样也可以起类似HotStart的功能，防止非反应条件下错误的聚合反应造成的污染。当然，有Qiagen极为严谨的HotStart酶，这样的步骤倒也不是必需的。    

    要得到良好的反应结果，也有一些方面需要注意，首先QuantiTect的HotStarTaq需要在第一轮反应参数中增加15分钟95°C的激活程序——当然这对于一般的定量PCR仪没有问题。另一方面，定量PCR强调的是快速检测，通常可选择模版上较短的片断做定量PCR模版，QuantiTect最佳扩增长度为100-150bp，不超过500bp为好，需要注意。Qiagen去年还推出一个只要95度5分钟激活的HotstarTaq plus版本，为的是适应快速反应的需要。但是对于精确要求高于一切的定量反应，厂家还是坚持采用最严谨的态度。

    由于荧光染料法适用于各种型号的机器，QuantiTect SYBR系列可以适用于iCycler iQ；ABI PRISM 7900, 7700, 和7000；Applied Biosystems 7500和7300；GeneAmp 5700；LightCycler 2.0（包括早期型号）；SmartCycler sytems ；Rotor-Gene 3000；Mx4000, Mx3005P, 和Mx3000P；MJ的DNA Engine Opticon systems。使用到ABI和Stratagene等96孔板系列定量PCR仪器的时候需要用到阴性染料对照（ROX dye）作为管间对照平衡，在试剂盒中有提供。更为贴心的是，针对不同型号的机器，厂家都给出了优化条件和特定的程序、调教本底参数的建议值——不要小看这些建议，可都是经过严谨的实验得出的心血，对于新手的迅速熟悉使用有莫大的帮助，节约很多时间。

基本的实验流程如下：

                     

    QuantiTect有着很高的灵敏度，检测下限可精确至5个拷贝的模版（见下图）。好东西不用多说，看实验对比图片足以说明问题。因此，如果您正在选择定量PCR试剂，可以考虑这种特异性强，操作简便的荧光染料试剂盒。Qiagen的产品质量一向口碑很好，值得信赖。最近浏览生物通相关文章还有机会获得生物通商城超级优惠券，可以低至5折的价格购买各种Qiagen产品，如果参加Qiagen读者调查更有机会获得40次反应的QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒试用装呢！

The template was 1 x 10⁶ to 5 copies of a plasmid containing a human CFTR gene fragment (in a background of 50 ng maize genomic DNA with no CFTR gene). CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) is a cAMP-regulated chloride channel. NTC: No template control

　

Specific Quantification Over a Wide Linear Range on the Rotor-Gene 3000 Dilutions of human leukocyte cDNA were analyzed using the QuantiTect Primer Assay for human BAX and the indicated kits. Highly specific quantification with the QuantiTect Kit and Assay is demonstrated by the single peak in melting curve analysis and the flat curve for the NTC reaction. NTC: No template control.

Specific and Sensitive Quantification on the Applied Biosystems 7500   Dilutions of human leukocyte cDNA were analyzed using the QuantiTect Primer Assay for human IL8 and the indicated kits. Only the combination of QuantiTect Kit and Assay provided highly specific quantification, as demonstrated by the single peak in melting curve analysis and the flat curve for the NTC reaction. NTC: No template control.

二、ABI 的金字招牌(未完待续)