定量PCR:“酶”头一蹙，计上心来 Qiagen vs.ABI(1)[选购宝典]

【字体：大中小】 时间：2006年05月18日 来源：生物通

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(生物通技术专题之定量PCR篇) 要想解决定量PCR反应中SYBR荧光染料的非特异性问题，其实和解决常规PCR的非特异扩增是一样的考虑方向。引物设计绝对是首选的考虑对象，然后就是DNA扩增酶，因为DNA扩增酶是限制PCR扩增反应的一大关键要素，而且我们也确实积累了不少经验。

做完PCR后电泳检测经常能看到一些非特异扩增的条带，虽然通过电泳分析可以区分并分离出目的条带，但是对于荧光染料法检测实时定量PCR分析来说，荧光染料并不能区别目的产物和非特异产物，这些非特异扩增产物就成为无法校正的可怕误差，而且重复性不高。这些讨厌的副产物是怎么来的、如何才能避免呢？前辈的经验之一是：Taq酶虽然最佳延伸温度是在72℃，然而从室温到高温上限这个广阔的范围内仍有非常强大的活性——这就意味着在反应建立的初期，一旦PCR反应体系中混合了酶、引物、模板等全部反应元件后，“生机勃勃的”Taq酶就已经“开工干活”了——虽然这个升温过程中模版可能有二级结构没有完全解链，或者还存在引物二聚体、错配，可我们勤劳的Taq酶并不管这些3721，继续高效率的“瞎忙活”——因而也就可能产生一些不完整的产物或者非特异的产物，“混入”模板队伍中，在随后的扩增中一道被扩增，成为讨厌的非特异产物。因此，首先是好的引物设计，其次，热启动（hot start）就是提高PCR 特异性最重要的方法之一了。土办法是将酶加到管壁上，等到94度再混合或者94度后才加酶——可是样品数多就来不及了吧。商业化的热启动Taq酶就应运而生了，比如较早期用WaxBeads蜡珠包裹酶待温度升高到50度左右腊质熔化释放Taq酶；加入Taq酶抗体待温度升高70度左右抗体失活释放Taq酶等等，但是这些方法都比不上最严谨的方法——化学修饰Taq酶—— 一种需要加热到95度以上才能恢复活性的Taq酶。

一、Qiagen的酶学策略+预证引物设计

QuantiTect Primer Assays

引物设计，特别是SYBR Green方法做real-time RT-PCR的引物设计是比较考功夫的——引物的专一性是结果特异性的最重要保障，当需要选择较小的片断而非全长基因来做定量时，自行设计引物如何保证专一性和特异性有时不免令人头疼。QuantiTect Primer Assays是Qiagen特别为SYBR Green方法做real-time RT-PCR 而设计的引物对，涵盖人类、大鼠、小鼠等7个物种基因组上13万多个基因，这些已经反复优化、经过预证的引物对能100%保证提供高度特异和灵敏的结果，最大的好处就是你可以节约很多时间，不必再为自行设计引物而头疼，避免由于引物设计不当、或引物合成/纯化问题而得不到理想的结果、以及避免由此而导致的精力、时间和实验材料的浪费——有的时候时间就是金钱，由于总是得不到理想的结果而不得不反反复复地重复实验，这种苦头大家或多或少都有体会吧？QuantiTect Primer Assays经过Qiagen专家反复验证，保证不会出现引物二聚体，能保证得到的结果在相当宽范围内的保持良好的线性关系，得到比探针法更灵敏的结果，那就不需要考虑更加昂贵的荧光探针法了，所以从某个角度来说，购买预证引物能省时省事，也能省钱的。用来快速做基因表达分析、基因沉默验证或者是DNA芯片结果的验证非常合适。当然，Qiagen预证引物对的合成质量、纯度你都可以绝对信赖，如果能打个较大的折扣，那么近千元一对的预证引物（足够做200次50ul反应，或者500次20ul反应）折半下来就不那么吓人了，毕竟是专家预证过的引物啊。到底是省事省时还是省钱？如何权衡得失还要自己考虑。现在2位生物通的幸运读者将可获赠Qiagen公司提供的QuantiTect Primer Assay引物各一对，需要申请的读者请回答调查问卷，并自行到Qiagen的GeneGlobe portal上检索你需要的目的基因引物编号。geneglobe数据库提供方便的检索界面和详细的基因特异性产品的信息，包括转录本的信息和图示，引物扩增区段的位置和扩增区段的长度。另外，针对于同一基因的探针和siRNA也可以在同一个数据库里面找到。值得注意的是，这个Primer的设计针对于mRNA检测，不会检测到gDNA，所以即便样本没有经过DNase处理也没有问题。当然，如果是单外显子基因，或者有假基因存在的话，检测到gDNA是不可能通过primer的设计来避免的。