定量PCR新技术报告之一：UPL定量PCR通用探针库[选购宝典]

Tagman探针是定量PCR最常用的探针方法,特异性高,可是单独合成价格贵时间长,Universal Probe Library通用探针库既有Tagman探针高特异性又有荧光染料方便价廉的优点,值得一试

    PCR无疑是目前最常用的实验室技术之一，而由PCR发展出来的定量PCR技术，不单有PCR的快速灵敏，还以专一性更高、可实时监控、可重复精确定量等优势而日益受到重视，越来越广泛应用于科研、检验、和诊断领域。例如，今年3月美国疾病预防与控制中心专家来华访问中就提到过，要预防控制类似SARS、禽流感以及潜在高度危险的未知传染病、乃至未来潜在的生物恐怖活动威胁，需要决策人及时采取适当应对措施，而这其中的关键就在于快速和准确地判断病源和发展趋势。这种时候，时间就是金钱，就是生命，一点都不为过；而检测的准确可靠性，乃是采取适当措施的先决条件，其重要性更加是不容置疑的。定量PCR正是兼有准确和快速的优势而在美国疾病控制中心得到广泛的采用。生物通去年在仪器龙虎榜栏目中特别撰文介绍定量PCR之选则宝典(1):背景和原理；以及定量PCR仪之选择宝典(2):各自精彩的选择。那么今天，荧光定量PCR市场又推出了哪些值得关注的技术呢？

第一站：给定量PCR基因表达分析一张新的面孔——UPL

    实时荧光定量PCR的原理并不复杂(参考前文定量PCR之选则宝典(1):背景和原理)，目前主流的荧光定量PCR大致可分为染料法和探针法。SYBR Green I位代表的核酸染料法通用性好，可是专一性不高；我们所说的定量PCR专一性更高，主要是指探针法——因为探针法定量PCR增加了1到2条基因特异的探针，从而大大减少了假阳性的发生，可是每个基因都需要专一对应的探针，需要单独设计和合成——这显然需要不少时间和成本，不利于大规模高通量基因表达分析的顺利进行。有没有什么新方法有助于解决这个问题呢？在去年4月的Nature Methods杂志（题目为ProbeLibrary: A new method for faster design and execution of quantitative real-time PCR）上出现了一个定量PCR技术的新面孔——Universal Probe Library通用探针库，这个“新进职员”为定量PCR探针设计以及实验分析带来了新的气息。

姓名：UPL通用探针库（Universal ProbeLibrary™）

出生地：罗氏诊断应用科学部联合Exiqon公司

快照：UPL通用探针库（Universal ProbeLibrary™）选取各转录组中高频出现的165个8－9个碱基序列；同时在探针合成中采用了LNA技术(Locked Nucleic Acid)大幅度提高了探针的熔点温度，可识别出单个碱基的错配，借助扩增过程中的基因特异性引物的使用，确保了qPCR反应过程中的灵敏度和特异性。

特征：

• 准确可靠的实验结果，可广泛应用于基因表达研究分析
  165个探针提供超过2,600,000实时PCR的检测分析方法，其中超过50,000种以上为跨内含子区域检测，更可实现对同一基因不同跨内含子方法检测 

• 低成本，高特异性的检测方式
  水解探针的特异性，SYBR Green I的价格；同一探针配合特异性的基因引物可以实现对多个基因的检测 

• 最少的时间投入，最高的设计效率
  30秒钟完成对人类，小鼠，大鼠，果蝇，拟南芥，线虫及灵长类动物的特异性跨内含子定量检测方法的设计，成功率达96％ 

• 完整的预制备特异性探针，满足随时实验的需要
  无需等待探针合成，大大提高时间利用率 

• 标准化操作流程，适用所有荧光定量PCR机型
  无需特殊硬件及使用环境限制，完全开放 

原理：

几个概念

LNA技术(Locked Nucleic Acid)：这是一种近几年发展起来的核酸化学修饰技术（第三代反义寡聚核苷酸），即通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来（见下图）。由于将LNA导入DNA分子会引起DNA·RNA杂合分子的构像改变为A型螺旋，阻碍RNaseH降解RNA。经过LNA修饰的DNA分子在PCR反应能增加反应的稳定性和靶标亲和性。据报道寡聚核苷酸中每引入一个LNA可以将熔解温度（melting temperature）提高9.6℃，强化后的杂交性能可以显著扩大实验检测的环境限制，可识别出单个碱基的错配，同时允许在单试管中进行更复杂的实验。

    

水解探针（Taq探针）：定量PCR扩增的检测方法后期主要是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，可以分为直接法和间接法，直接法即标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，比如分子信标（molecular beacon）本质上是一种标记荧光的发夹探针；间接法是利用水解探针的策略，目前在RT-qPCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理——PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，由于5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。（具体见定量PCR仪之选则宝典(1):背景和原理）

UPL探针：如何体现通用性？

     在定量PCR的分析中，检测模式的灵活性和特异性好像永远是一对无法调和的矛盾——特异性高的必然通用性差，也就意味着不灵活；而通用性高也几乎等同于特异性差。老实说，要将这二者统一起来的设想很“Wild” ，要理解其中的奥妙，还是需要有一点点想象力的。

    UPL主要是通过生物信息学分析方法从人类、小鼠、大鼠、其它灵长类动物、果蝇、拟南芥和线虫这7类研究领域的主要模式动物转录本序列（见下图）中，一共筛选出165个长度为8—9个碱基的预证探针（prevalidated）——这些探针对应的短序列可以说是这7个物种全部转录本中最具“通用性和代表性的，或者说是最常出现的”——以人为例每段短序列可能出现在超过7000个基因中，也就是每个探针可用于检测7000多个基因！165个探针组合为7组，每组包含90个探针并对应一个物种的转录组，基本可以覆歉梦镏?5%—99%以上的转录本序列！看看左边这个图，想象一下，要是实验室里拥有这么一盒90管探针，使用相应的ProbeFinder 软件可以组建 644,000不同的反应并能覆盖人的转录本的99％（NCBI RefSeq database），就可以随时做几乎整个人类转录本的定量PCR了？！Cool！而且7个不同转录组每组90个探针的组合，可以覆盖7个目前最为人熟知的物种全部的转录组序列，用于整个转录组的研究需要。

    同样以人为例，每个人类基因转录本可包含多达19个探针结合位点，也就是可以用19个探针检测，这样就意味着可以设计出同一探针对多个基因的检测以及针对同一基因上几种跨内含子的检测方法。165个通用探针库可以设计出200多万定量实时PCR的检测模式，其中有超过70万种以上的为检测跨内含子区域（所有这些复杂的设计过程都可以通过UPL通用探针库的免费在线设计服务中心轻松完成）。

	Probes per transcript	Transcripts per probe	Intron Spanning Assays Available	Total Assays Available	ProbeLibrary Coverage
Human	19	7137	>155 000	>639 500	99%
Mouse	16	5781	>140 400	>509 500	99%
Rat	13	3990	>128 000	>364 000	98%
Primates	14	5903	>174 500	>519 500	96%
Drosophila	14	2936	> 65 500	>253 500	99%
Arabidopsis	8	2271	> 59 500	>199 000	98%
C. elegans	6	1586	> 38 500	>134 000	95%
Total			>761 400	>2 619 000

如何保证专一性？

   我们知道，探针长度和其特异性有关，越短的PCR探针特异性越低，一般而言PCR探针不低于15个bp，Taqman探针长度则以20-35bp为合适，较长的探针可保证其Tm值比引物高8到10度，避免退火时探针先于引物和模板结合。但是UPL探针本来就是通用探针库，所以UPL探针长度为8－9个碱基序列，5'端标记FAM(fluorescein)荧光基团，3'端标记荧光淬灭基团，并利用LNA技术提高探针的Tm值，确保UPL探针退火温度高于引物。看到这里，你可能早就憋不住了：一个探针可识别7000多个基因，谈何专一性呀？那就要靠基因特异的引物和探针的共同作用了。毕竟PCR反应中保证专一性最基本的是引物，增加水解荧光探针作为检测依据，由于通常非特异扩增不会产生信号，所以足够体现检测结果的专一性。如果要更加严谨，由于每个基因都可以对应多个探针，也许同时用2个以上探针检测一个基因，就能更高程度保证反应结果的专一性了。还记得Affymetrix基因芯片的探针设计吗？（基因芯片探针设计与杂交条件的优化策略）每个探针都是25mer的Oligo以保证杂交条件的均一性，可是25mer不足以代表一个基因，于是将基因特异的序列分解为一组若干个25mer探针，这样，根据基因芯片上这一组探针们的信号就可以更加精确判断某个基因是否表达。同理我想也可以用于UPL吧？只是反应成本就会成倍提高了。

成本如何？

    快捷性是罗氏推出这一款产品的重头戏。既然说到反应成本，自然也要和传统方法对比一下：一般利用类似Primer designer来设计Taqman探针，合成标记和运输的时间往往需要一周，再到具体的实验操作和数据分析，有的时候因为种种原因还需要重新合成探针；对于不同基因的研究还需要合成不同探针，时间和成本都不少。UPL以在确保每一个探针的灵敏度和特异性的同时也提高了探针的使用效率，简化了程序。由于将探针设计这一步骤付之专业化系统化，因此研究人员在分析实验数据的时候可以将进行这一步骤中可能出现的个人错误忽略掉，节省分析的时间，延伸思考的空间。平均每个反应的费用呢，和SYBR Green I 反应的成本差不多——注意，这里指的进口同类产品的价格，和国产有差距的哈，而且是整个Kit的平均每次反应的价格，要是买个Kit才做10来20次可就不是这么讲啦。具体价格要问Roche。虽然构思和设计也要成本，不过7个不同的Kit，一共就165种探针嘛，批量生产成本应该不高哦，价格也许？

主要流程：

    探针通用了，Primer可不能通用。Primer还是要自己设计和合成的。这个倒是便宜的，虽然图片上的隔日送到描绘的可能不是每个地方的研究人员都能享受的情况，好在引物合成在国内现在也蛮快的。相信每个实验室手头都有自己惯用的Primer设计软件。如果有兴趣采用这个UPL，那可以暂时放开手头的软件了，登录网上设计中心可以免费获取引物序列和探针号码。Assay Design Center和ProbeFinder software可以为你的反应提供包括引物、探针在内的多种建议。UPL是标准开放设计，适用于各种定量PCR仪。据厂家提供的数据，在设计175个常用人类RefSeq转录本RT-qPCR反应时，按照软件提供的第一选择的反应条件，成功率为84%，按照软件提供的第二选择又有12%成功率，总和达到96%。通过软件设计目的基因的引物并提供ProbeLibrary 不但提高了检测的特异性而且也使得qPCR变得灵活轻松和快捷。适用于基础生物研究，疾病诊断，毒性分析，药物筛选和DNA microarray的表达验证。（生物通：张迪）