[候选优秀论文]荧光定量PCR技术的应用

　　

【编者按】：为了鼓励更多的优秀论文在国内的核心刊物发表以及鼓励和发掘极具潜力的青年科学家，表彰优秀的实验成果，国内的一些核心期刊、生物产品厂家与生物通联合举办了这次中国05-06生命科技年度优秀论文评选活动。为了让广大读者能够从这次活动中了解更多的国内科研进展，同时了解更多的科研技术，生物通将对获得投票数较多的文章进行介绍。这次介绍的是目前暂时投票数领先的文章。

定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。

PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：

（1）SBYR Green I 检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。

（2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。

（3）杂交探针（Hybridization Probes）模式。温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。

狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。

在2006年1月第39卷第1期的《中国农业科学》中有三篇文章应用到荧光定量PCR技术，它们是：

利用实时定量PCR 对瘤胃甲酸甲烷杆菌定量方法的建立与应用

作者：赵玉华, 王加启

单位：中国农业科学院畜牧研究所反刍动物营养研究室

摘要：【目的】解决传统微生物评价方法存在的弊端，寻找快速、准确、灵敏的瘤胃微生物评价的新方法。【方法】利用实时定量PCR 技术，以16S rDNA 为靶序列，建立了瘤胃甲酸甲烷杆菌（ Methanobacterium formicicum）的分子定量方法。【结果】采用本文所设计的引物、探针以及相应的PCR 反应体系，检测极限可达到30 拷贝（15 个甲酸甲烷杆菌），与传统检测方法相比要更为迅速、灵敏。采用实时定量PCR 技术所测得的细菌数量与采用传统的最大或然数记数法所测的细菌数量具有很高的相关性（ r=0.957， P<0.01），表明采用实时定量PCR 方法能够准确反映瘤胃微生物数量的变化。利用所建立的方法对利鲁杂交肉牛和荷斯坦奶牛瘤胃液中甲酸甲烷杆菌进行了定量检测。结果表明，利鲁杂交肉牛瘤胃液中的甲酸甲烷杆菌浓度是荷斯坦奶牛的5.6 倍。【结论】利用实时定量 PCR 技术建立的瘤胃甲酸甲烷杆菌的分子定量方法能够准确反映瘤胃微生物数量的变化。[投本文一票]

荧光定量RT-PCR 法检测运输应激猪热休克蛋白mRNA 转录水平

作者：李玉保1，2，鲍恩东1，王志亮2，赵茹茜

单位：1 南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室；2 农业部动物检疫所

摘要：【目的】探讨应激时热休克蛋白mRNA 转录水平的变化。【方法】根据HSP90、HSP70和GAPDH mRNA 序列，设计并合成引物，将PCR 扩增的基因片段克隆到pGEM-T 载体，重组质粒经筛选、鉴定，体外转录出RNA，梯度稀释作为阳性模板，用于标准曲线的制定和样品检测，建立了一步法实时荧光定量RT-PCR 技术平台，并用于检测长途运输猪心脏和肝脏中HSP70及HSP90 mRNA 转录水平的改变。【结果】经1、2、4、6 和10 h 的运输应激后，组织中HSP70 mRNA 的转录水平随着运输应激时间的延长一直呈现出上升的趋势，运输应激到10 h 时HSP70 mRNA 的转录水平升到最高，肝脏和心脏组织中HSP70 mRNA 的转录水平分别为对照组的2.5 和4.1 倍；HSP90 mRNA 的转录水平则随着运输应激时间的延长呈下降趋势。【结论】运输应激可以影响HSP mRNA 转录水平的变化，并且对不同家族的HSP mRNA 转录水平的影响不同；HSP70 mRNA 的转录水平有望成为猪运输应激的判定指标之一。[投本文一票]

SYBR GreenI 模式荧光RT-PCR 鉴别新城疫病毒毒力

作者：弋英1，2，陈继明1，王志亮1，孙承英1，鲍恩东2

单位：1 农业部动物检疫所；2 南京农业大学动物医学院

摘要：【方法】根据NDV 的F 蛋白裂解位点附近的序列，设计分别对应于NDV 强毒和弱毒的两对引物，然后用SYBR Green I 模式的荧光RT-PCR 方法比较两对引物对同一NDV 的RNA 扩增效率以及扩增产物的Tm 值，来区分 NDV 的毒力。【结果】对8 株NDV 进行检测并测定其鸡胚平均致死时间（MDT），荧光RT-PCR 方法的检测结果和MDT 测定的结果完全一致，说明此荧光RT-PCR 法可用于NDV 毒力检测。[投本文一票]

快讯：最新的排行榜中，《单核苷酸多态性检测方法的研究进展》一文获得众多研究人员青睐，投票数节节上升，很快进入十大行列，排名第十。

（生物通编辑 朱方雨、谢菲）

中国05-06生命科技年度优秀论文评选活动

候选文章选介：

第一站文章：

[候选优秀论文]南京大学王亚平研究小组（基因突变检测技术）

[候选优秀论文]军事医学科学院杨晓（转基因小鼠的建立）

[候选优秀论文]浙江大学朱军研究组（基因芯片结果聚类分析新算法）

第二站文章：

[候选优秀论文]哺乳动物细胞RNAi进展（华中农业大学 樊斌）

[候选优秀论文]研究基因调控的新技术（南开大学 张琚）

[优秀候选论文]数量性状座位QTL分析（中国农业科学院 景蕊莲）

[候选优秀论文]分子标记指纹分析技术（中国农业科学院 杜雄明）

[候选优秀论文]大规模蛋白质组表达谱研究（军事医学科学院 贺福初，朱云平）

第三站文章：

[候选优秀论文]东南大学 谢维（利用RNAi和DNA芯片技术分析癌症相关基因）

[候选优秀论文]**** 邓红文 （基因与相关性状分析）

[候选优秀论文]基因功能初步分析 （中国工程院院士 郭予元）

第四站文章：

[候选优秀论文]microRNA综述（新加坡国立大学 Yong Kong）

[候选优秀论文]启动子捕获技术（华中农业大学 张献龙）

[候选优秀论文]人类人工染色体（吕凤林，第三军医大学）

第五站文章：

[候选优秀论文]核酸检测方法进展（周国华，华东医学生物技术研究所）

[候选优秀论文]荧光定量PCR技术的应用