点评2006生命科技优秀论文卫冕论文之一

　　

编者按：为了鼓励更多的优秀论文在国内的核心刊物发表以及鼓励和发掘极具潜力的青年科学家，表彰优秀的实验成果，国内的一些知名核心期刊、生物技术公司与生物通联合举办了中国05-06生命科技年度优秀论文评选活动。此次评选活动已经进入了决赛阶段，最后“万”元大奖的获得者将从50多篇文章中诞生，目前有一些值得关注的决赛文章浮出水面，很有可能即是此次的“卫冕之王”。

候选论文：一种通用高效的复杂载体构建的新方法 遗传 2006.2 Vol 28, No.2     212-218

文章摘要：

《一种通用高效的复杂载体构建的新方法》报道了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法是在PCR引物设计时，在目的片段5′端加上随机设计的接头，利用PCR克隆目的片段，再用T4 DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段，产生多个首尾相匹配的粘性末端，进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建为例，应用上述方法构建只需做两次连接、转化,且其重组、转化效率高。数10次实验证明：这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法，该法至今尚未见报道。[投本文一票]

技术要点：

要点1：T4 DNA polymerase具有3’到5'方向的外切酶活性，可以作用于双链DNA，它能将DNA链上的碱基从3’到5'方向一个个地切下：同时该酶又具有5'到3’方向聚合酶的活性，在dNTP存在的条件下表现出聚合酶的活性。因此文章利用这一特点加入一种特定单核苷酸对设定的位置使T4 DNA polymerase的外切停止，而合成其设计的黏性末端。

要点2：随机设计接头，在这篇文章中主要是通过

因此分别设计了TATC—GTAC，TGAC—ATAC，TACG—TCAG，TGAC—ATAC，TATC—TTTC和AAAC—GTAC引物接头，完成7个片段的拼接。

技术优点：

• 设计操作相对简便

    常规的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂的载体时，往往设计、操作较麻烦，通常要构建多个中间载体，需要多次连接"转化，既费时又费力。而用这一方法构建复杂载体，可以减少部分中间载体的构建，减少连接、转化次数，大大提高工作效率。如果应用常规的载体构建方法构建以上7片段拼接的水稻单交换质体定点表达载体需要做6次连接、转化，构建不同的中间载体5个，而应用这种方法构建此载体只需连接、转化2次，构建中间载体一个。

• 通用性

    利用这种方法，在PCR引物设计时，在其5’端加上随机设计引物接头或在目的片段内直接找接头而不需要引入新的碱基，利用PCR克隆目的片段，再用T4DNA聚合酶3’至5’外切酶活性处理PCR克隆目的片段，产生多个首尾相匹配的黏性末端，进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。这样就可以不用寻找合适的酶切位点，也不用引进新的酶切位点，不破坏目的片段的完整性，可省去部分酶切，还可以作定向克隆。

• 高效性

    这一优点主要表现在：有些目的片段的PCR克隆、消化和磷酸化可同时进行，这样可以节约大量时间；用DNA聚合酶处理片段产生黏性末端的连接效率比内切酶的高。从理论上分析T4DNA聚合酶3’至5’外切酶活性在相同的时间内消化不同片段接头的碱基的能力比较接近，经DNA聚合酶处理产生的多个首尾相匹配的黏性末端，提高了片段之间的连接效率，从而提高了重组、转化效率。而用不同的酶进行双酶切，因其酶切效率不同，会直接影响其连接效率和转化效率。