西南大学973项目文章改进RNAi实验方法

　　

生物通报道：构建hpRNA（hairpin RNA）高效克隆和表达载体用于特定基因表达调控是RNAi技术应用研究的热点之一，来自重庆西南大学生物技术中心（Biotechnology Research Center, Southwest University）的研究人员就ihpRNA (intron-containing hairpin RNA，含intron发卡结构RNA)构建方面提出了一种新颖的PCR介导的技术方法，这种ihpRNA构建体（construct）可以克隆进任何表达载体，为RNAi技术手段提供了新思路。这一研究报告发表在11月的“BioTechniques”上。

领导这一研究的是来自西南大学生物技术中心的裴炎教授，以及肖月华和侯磊等，这一研究受到国家重点基础研究发展规划资助项目(973) (No. 2004CB117300 to L.H.)和国家自然科学基金项目(No.30200177和30471055 to Y.-H.X. )资助。

原文摘要：
BioTechniques November 2006
Volume 41, Number 5: pp 548-552
Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA
[Full text]（全文免费）

基因沉默(gene silencing)是转基因植物中特定基因由于种种原因不表达或表达量很低的遗传现象。一方面，基因沉默为利用遗传操作创造遗传修饰物种(genetically modified organisms，GMOs)造成障碍；另一方面，它又为研究基因功能及植物基因表达调控提供了新途径，即通过有选择地抑制特定基因的表达来创造功能缺失体。可利用反向遗传学方法进一步研究基因的功能，或直接利用创造的特殊性状变异体进行植物改良，同时在植物发育的不同阶段抑制特定基因的表达，对发育生物学研究也具有重要意义。 

根据基因沉默发生的时期，基因沉默分为转录水平的基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)和转录后水平的基因沉默 (post-transcriptional gene silencing，PTGS)。前者通常与DNA甲基化有关，表现为mRNA不能正常合成，造成基因失活。有研究表明，外源基因较内源基因更易甲基化，但外源基因甲基化不表达不一定影响内源基因的表达。后者虽能合成mRNA，但随后被降解而不能积累，并同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默。近年来随着转录后基因沉默机制的深入探讨，使人们能够利用它有目的地使特定基因降低表达或不表达，PTGS技术在功能基因组学和植物改良中显示出巨大的应用潜力。

其中构建hpRNA高效克隆和表达载体用于特定基因表达调控是目前RNAi技术应用在植物研究的热点之一，当hpRNA载体导入植物体后，在转录过程中产生mRNA发卡结构，发卡茎部形成稳定的dsRNA诱导同源的内源基因沉默。如果在靶基因的反向重复序列间加入一段非编码序列，如intron，在植物体内转录形成含intron的发卡结构(intron splicing hpRNA，ihpRNA)，则可以沉默大约80%到100%的转化株（transformant），沉默效果与hpRNA相比可从58％提高到90％。

为了方便获得ihpRNA构建体，目前已经有了几种包含有功能性内含子的通用载体，但是这些方法通常都需要通过长引物或者几轮restrictions和ligations的重复构建对目标基因进行扩增，因此急待一种方便有效的快速获得ihpRNA构建体的方法。

在这篇研究报告中，西南大学的研究人员发展了一种新颖的ihpRNA直接PCR扩增的方法（directed amplification of ihpRNA ，DA-ihpRNA)，可以从基因组DNA中一管直接获得一个ihpRNA构建体，并且这种ihpRNA就像是正义或反义链基因一样可以克隆进任何表达载体。

（ihpRNA构建过程）

（生物通：张迪）

附：
裴炎

男，四川省成都人，汉族，生于1948年9月。中共党员，教授，博士研究生导师，

1985年1月，西南农业大学遗传育种专业研究生毕业，获硕士学位，1996年11月，西南农业大学昆虫学专业毕业，获博士学位。现任西南农业大学生物技术研究中心主任，校长助理，国家自然科学基金农学学科组评审专家成员。第二届高等农业院校教育指导委员会学科组成员，第二届农业生物技术学会理事，重庆市高新技术产业发展专家咨询委员会成员。重庆市科技顾问团成员1993-1994年受国家教委委派，赴瑞典农业科学大学植物育种系DNA实验室进行分子生物学和基因工程技术。主讲本科生的"生物工程原理"、"基因工程"等课程，研究生的"农业生物技术"、"分子生物学技术"等课程的教学工作。编著《生物工程原理》、《科技英语》，参加编著《棉花》等教材。在国家核心刊物：《植物学报》、《植物生理学报》《动物学报》、《昆虫学报》、《微生物学报》及《Plant Breeding》等14种刊物上公开发表论文："苦瓜几丁酶的纯化及性质"、"棉花冠层结构及光合作用研究"、"芽孢杆菌S-1菌株对棉花主要病害的抑制作用"、"抗真菌多肽APS-1的纯化与特性"等40余篇。

在科研方面，主持国家转基因植物专项计划项目，主持和参加国家自然科学基金项目5项。中华农业科教基金项目、农业部"八五"生物技术项目等4项，四川省科委资助项目4项，重庆市科委项目6项，横向合作科研项目5项，获准经费250万元以上。

目前主要从事作物分子标记辅助育种、作物抗性的分子学基础、抗病抗虫基因的分离与克隆、植物基因工程、生物大分子物质的纯化与功能。在棉花、油菜等作物抗病、优质的基因工程方面已获重要进展，植物病程相关蛋白：植物几丁酶、-1，3-葡聚糖酶、TL(Thaumatin like)蛋白的纯化、功能与基因克隆方面取得进展。从微生物和昆虫中纯化出多种抗菌物质，其中抗菌多肽APS-1，不仅对真菌有广谱抗性，对一些细菌也有明显抑制，是一种新的抗菌多肽，具有良好的潜在应用价值。研究了昆虫病原真菌分解寄主外壳蛋白酶的纯化及基因克隆，杀虫真菌的研究已取得重要进展。在作物重要性状的DNA分子标记研究方面，利用AFLP、RFLP、SSR等技术已筛选出与油菜、小麦雄性核不育、棉花产量性状相关的分子标记，正在研究与棉花纤维和花粉发育相关的基因。

主研参加的"棉花多抗育种及其理论基础研究"，1994年获四川省科委科技进步一等奖。"重庆市食品工业生物工程发展规划研究"，1989年获四川省科委优秀软科学三等奖。1991年获四川省教委"做出突出贡献的中国硕士学位获得者"称号。1995年获"农业部部级有突出贡献的中青年专家"、"四川省优秀教师"、"重庆市留学回国人员先进工作者"称号。1997年获"国家级有突出贡献的中青年专家"和"重庆九五立功奖章获奖者"称号。享受政府特殊津贴。