863计划成果：海洋所PCR检测技术获法国专利

　　

生物通综合：10月11日，由中国科学院海洋研究所莫照兰等完成的“鳗弧菌的PCR检测方法”获国家发明专利授权。该发明是该所863计划项目的一大成果。

 

        该发明涉及水产动物疾病的诊断技术，是一种对养殖动物鳗弧菌的PCR检测方法，包括PCR检测试剂的配制及一次PCR、一次PCR扩增产物分析等一套检测操作程序，并增加了二次PCR处理程序。研究人员从海洋鱼类重要病原菌——鳗弧菌基因库中选择金属蛋白酶基因为目标检测基因,以此设计一对引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测鳗弧菌的方法,并对此方法的灵敏性和特异性进行了研究,结果表明该方法对鳗弧菌的检测快速、灵敏。对人工感染鳗弧菌的花鲈组织样品进行检测表明，该方法能识别组织样品中极微量的鳗弧菌。

 

与其它弧菌病原检测技术相比，该发明具有如下优点和积极效果：一是采用该发明方法检测十分迅速，4～8小时即可获得检测结果，而其它方法则至少需要1天甚至一个星期以上；二是该发明在一次PCR的基础上进行二次PCR，进一步提高了检测的灵敏度，可以检测下限低至1～10个左右的细菌，而现有的其它技术方法必须经过一定时间的纯培养增殖达到105后才能进行检测；三是该发明应用范围广泛，可以检测养殖动物遭受鳗弧菌感染的情况，也可以监测养殖水体环境中鳗弧菌，还可以检测养殖饲料和鲜活饵料是否遭受鳗弧菌污染。

        鳗弧菌是其中一种非常重要的弧菌性病原，能够引起养殖鱼类的皮肤溃烂、肌体出血和死亡，危害十分巨大。目前病原性鳗弧菌的检测方法主要有生理生化鉴定技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验和16srRNA基因探针杂交技术，这些方法在检测时间、稳定性、敏感性等方面存在着一些不足。PCR检测方法在样品中含有少量的细菌的情况下就能准确检出，是一种具有敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法。

 

人物介绍：

 

莫照兰，女,1967年生,博士,副研究员;研究方向:海洋微生物学与水产动物病害学

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海洋所863计划项目成果

“海水养殖动物病害控制技术”专题研究取得重要进展

　　随着海水养殖业的迅速发展，养殖的规模和集约化程度不断提高，病害发生日趋严重，大面积流行病频频暴发。据不完全统计，全国每年海水养殖病害发病面积高达70%，损失率20%以上，直接经济损失达数百亿元之巨，并且还有上升的趋势。863计划海洋生物技术主题海水养殖动物病害控制技术专题将大力开发病害的早期快速诊断技术和灵敏准确的病原检测技术。高效无毒的疫苗、免疫促进剂和新型渔药，研究养殖宏观容量与病害的关系，开发各种病害控制的生态环境调控技术，培育抗病健康苗种。该专题实施以来在病原早期诊断、疫苗和免疫增强剂研制以及疾病综合控制等方面的研发工作取得了重要进展，累计申请国家发明专利8项。

　　病原的早期诊断：建立了对虾复合PCR检测技术。根据对虾三种病毒（WSSV、HPV和TSV）的基因组序列设计特异性引物，在同一套反应体系内同时完成三种病毒的检测，灵敏度可以达到0.1pg以下；用复合PCR检测技术对从海南、广东顺德、浙江宁波和大连采集的样品进行检测，验证了该技术的灵敏性和可靠性。牙鲆淋巴囊肿病毒的早期诊断试方面，研制出核酸探针 － 点杂交早期诊断试剂盒，灵敏度达到了50pg，每个试剂盒可检测10-20个样品,可按需要实现产业化。

　　疫苗的研制：在减毒疫苗方面，根据已建立的鳗弧菌pEIB1质粒毒力基因组有关生物学信息，构建获得3株减毒疫苗株，已完成其中1株对牙鲆和美国红鱼的各项感染和免疫学评价，效果良好；根据开发的鳗弧菌减毒疫苗培养基，实现了5L反应器16hr内细胞干重22.4g/L的培养效率，完成了30L中试规模专用反应器的自制。在核酸疫苗方面，淋巴囊肿病毒衣壳蛋白基因序列在原核载体中的克隆表达成功；利用不同的限制性内切酶，将重组质粒中的0.6Kb核酸片段，先后转到质粒pcDNA3.1和pEGFP-N2中、构建了淋巴囊肿病毒核酸疫苗的真核载体，并获得了在真核细胞中的表达。在亚单位疫苗方面，提取了5种病原菌的4种亚单位成份，对其毒性和免疫学特性等进行了分析；开展了3种病原的3种亚单位基因（外膜蛋白、外毒素、耐热直接溶血素）的克隆、表达及表达产物免疫特性分析，并进行了工厂化疫苗生产工艺及其相关配套技术的研究，进展良好。

　　免疫增强剂的研制：确定出5个对虾病毒感染与机体免疫密切相关的免疫指标作为多糖类免疫增强剂筛选的敏感指标；已研制出对虾和鲍鱼用复合免疫增强剂；在临床实验中免疫增强剂可使对虾主要免疫指标提高1倍以上；高位虾池养殖对虾的存活率提高15-20%。在育苗方面，提高对虾蚤状幼体和糠虾幼体成活率20%以上，提高杂色鲍育苗期成活率25%以上。已生产各类免疫增强剂60吨，销售50多吨；在对虾养殖中推广使用24,000多亩，在鲍鱼育苗中推广应用到2000万只以上。

　　疾病综合控制与示范：建立了一整套的大菱鲆疾病的诊断和防治方法；中试示范养殖面积达2200 m2，养殖单产20.3-21.5 kg/m2，成活率达91.0-93.2％，示范面积、商品鱼养殖产量和成活率均达到课题考核指标。研制的“鲆乐系列”大菱鲆疾病防治药物已进入中试阶段，试用100余次，应用面积达20万米2，效果良好。研究确定了大菱鲆的最佳养殖容量为每平方米养殖40尾平均体重为200g的大菱鲆，可在4个月内达到商品鱼规格，并可获得最大的养殖效益。举办了一次大菱鲆病害防治研讨会，参加人员近百人。