核心PCR专利过期后，核酸检测市场新星

　　

生物通报道：聚合酶链式反应技术（PCR）已经发明了20年了。在这20年来根据这一获得诺贝尔奖的基本技术原理，已发展出许许多多的应用技术。今年9月初，一家第三浪潮科技公司（Third Wave Technologies Inc.）成功打赢一场与Stratagene的官司。陪审团认为Stratagene公司的FullVelocity系列QPCR和QRT-PCR产品蓄意侵犯了第三浪潮科技公司的侵入（Invader）专利技术。

有一些其它公司和第三浪潮科技公司一样，在PCR核心专利过期之后利用这些专利技术结合自己公司的创新技术申请新的专利。第三浪潮科技公司就希望以PCR核心技术为基础加上自己的侵入技术在核酸检测市场争有一席之地。

第三浪潮科技公司的总裁和首席执行官John Puisis先生就非常高兴地表示：“赢得了这场官司进一步增加了第三浪潮科技公司在核酸检测市场崛起的信心。在PCR核心专利过期后，许多公司都希望能进入到核酸检测市场来分一杯羹。核心的PCR技术加上侵入技术是我们独特的优势，我相信我们的技术可以比核酸检测市场上领先的TaqMan做得更好。以后第三浪潮公司将做出最好的产品，成为行业中的新标准。”

那么让Puisis先生这么引以为傲的技术究竟如何？首先让我们看看TaqMan荧光定量技术的原理。TaqMan荧光定量技术是以TaqMan荧光探针为基础，TaqMan荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，这样实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。

侵入技术与TaqMan技术相比最大的特点就是它不需要这种链式的扩增反应，它是对DNA或者RNA的信号进行扩增。

如下图所示，侵入技术使用了一种独特的切割酶，在特殊位点上切割DNA和RNA的核苷酸上形成的特殊结构（底物），两个寡核苷酸，一个是野生型（Wt）或突变型（Mut）探针，另一个是侵入寡核苷酸（invader oligo）纵向杂交到DNA是特异区域，生成精确的侵入结构（底物）而被特异的切割酶识别。

这种结构含有一个未配对的“翼”（flap），在下游探针（WT或Mut）寡核苷酸5′端上。当侵入结构（底物）形成时，特异识别侵入结构的切割酶将这个5′端的“翼”切割下来。之后在含荧光共振能量转递的通用报告系统的寡核苷酸探针上发生的第二次侵入裂解反应，反应释放的5′翼又充当了另一个侵入寡核苷酸再次形成侵入结构。第二个侵入切割反应进一步放大靶特异性产物。探针的5′端标有荧光基团F和淬灭基团Q。切割下来的5′荧光素标记产物用荧光板读取器检测，其荧光强度与Ｗt靶量成正比。如果没有生成精确的侵入结构，如在WT靶上用Mut探针时，就没有酶切，也没有荧光生成。从而当突变型和野生型的比值大于1/1000（Mut/Wt）时即可被检出。

该反应可在Wt或Mut探针的退火（Tm）温度下完成，不需要温度循环。由于探针是过量的，就可使每个靶产生许多信号（线性信号放大）。同样每个靶的特异性产物能增加许多探针的裂解。这种有序的裂解反应可使每个靶序列，每小时产生标记裂解产物10⁶～10⁷。侵入技术直接针对被检测靶DNA。在第一次侵入切割中，靶DNA是限速成分，因为侵入寡核苷酸和探针都是以摩尔过剩的。在第二次侵入切割中，限速成分是释放的“翼”。当两个切割反应依次完成后，来自复合反应的荧光信号对应靶DNA线性积累，得到成倍放大的信号。

侵入技术与PCR不同，它不是放大的靶DNA序列被检测。因此可减少由于PCR自身污染造成的假阳性。只有当特异的DNA存在时，这种方法才能使信号分析积累，并可用多种仪器检测靶信号。

侵入技术比起需要PCR扩增反应的TaqMan技术而言，不需要链式扩增过程，整个反应过程只要控制在探针的退火温度，不需要像PCR那样反复升温、降温，因此可以节省很多时间。同时它比起荧光定量PCR降低了成本，更加适用于高通量、大规模的核酸检测。利用这种方法可简单、快速、准确检测基因突变和单核苷酸多态性（SNPs）。目前已经在感染性疾病、遗传性疾病诊断及治疗药物选择中发挥重要作用。

生物通记者 朱方雨