走进MicroRNA的大世界

　　

序

2000年，RNA的研究进展被美国《科学》杂志评为重大科技突破；2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”；2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时， Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与HGP（人类基因组计划，生物通网站注）相提并论的最重大成果之一。 

聚光灯下的RNA已经逐步摆脱了DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新的挑战。随着RNAi技术在生命领域的应用，RNAi的主要作用物siRNA对研究人员来说已经非常熟悉。而同属于小分子RNA的microRNA(简称miRNA)则与RNAi和siRNA有着莫大的关联，但是miRNA和siRNA又有着多方面的差异。 

研究发现miRNA的主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，而且研究人员推测这种小分子调节着人类三分之一的基因！2005年6月至7月间，在顶级科学杂志Nature上先后发表了6篇有关miRNA的研究论文。这些最新的研究结果表明：miRNA还与病毒的复制有关（6月2日Nature）;淋巴瘤中，miRNA的一类miR17-92可能是潜在的致癌基因，并且发现一种叫做c-Myc的转录因子能调节miRNA（6月9日Nature）；在6月16日的Nature上的一篇文章表明miRNA是干细胞不断分裂必须的；而7月14日的Nature上的一项研究发现了miRNA在心脏形成过程中的一个靶标。另有研究表明miRNA还与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等病变有关。 

MiRNA到底是谁？你知道miRNA与siRNA的区别在哪里以及如何区别它们吗？它与RNAi有着什么样的关系呢？ MiRNA与疾病、生长发育有着什么样的关系？有关它的最新研究进展如何？…… 

在这流火的7月，让我们带着这些问题一起走进小RNA分子的大世界，走进生物通的7月的热点聚焦：microRNA的大世界。

第一回 MicroRNA的自白

 

“什么叫做浓缩的才是精华？我的一生都是在诉说着这个哲理。虽然我是五短身材，却能‘四两拨千斤’，我在生命中扮演的角色可不容小视。要想知道我究竟有多牛，你们还得好好研究研究呢！”，microRNA得意地说……

 

microRNA是谁？ 

MicroRNA也可以写做miRNA ，是一种21－25nt长的单链小分子RNA。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA）并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。

miRNA 5＇端第一个碱基对U（尿苷）有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。这种结合的结果就是导致基因的沉默。这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。

 

miRNA研究的开端 

miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个定时调控胚胎后期发育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs，并且发现它与多种重要的生命过程有关。 

 

MiRNA的作用方式 

miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度），这种miRNA是目前发现最多的种类；第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA；第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式：当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因表达的作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3´端非翻译区不完全配对结合后，抑制调节基因的翻译。

 

MiRNA的特异性 

研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性——在特定的时间、组织才会表达。

细胞特异性或组织特异性是miRNA表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

 

第二回  miRNA与近亲siRNA的差异

 

MiRNA不爽地说，“因为siRNA先被人注意到，所以它在我之前成名。”接着，miRNA意兴昂然地讲起了它的身世……

 

“话说在“广袤”的细胞质中游荡着一个名叫Dicer的浪子。与此同时，在细胞的腹地‘细胞核’中，一个身形颀长的RNA降生了即pri-miRNA。Dicer在细胞质中遇到了一个双链的RNA并被她所吸引，于是尾随她并最终在她身上咬了一口，结果siRNA降生了。Dicer又继续游荡，这时他看到了一个非常漂亮的发夹状的RNA（她其实就是在细胞核中降生的那条RNA的化身pre-miRNA），于是非常仰慕并最终历经艰辛将她咬了一口。这样我就“哇”的一声来到了这个世界上”miRNA说。“我和siRNA有许多共同点，但我们的差别也很多，所以可别把我们混在一起哦，”它补充说。

 

siRNA是RNAi途径的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。为了能够清楚地让读者弄清两者之间的差异之处，笔者特别将它们之间的差别划分入三个大的阶段：起源阶段、成熟阶段和功能阶段（即调节基因表达的作用阶段）。

 

在描述两者的差异之前，有必要先说一说它们的共同点：

1．  MiRNA和siRNA都是由22个左右的核苷组成；

2．  它们都是Dicer酶的产物；

3．  它们在起干扰、调节作用时都会和RISC复合体结合；

4．  它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译；

 

两者之间的主要差异：

起源阶段

SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后产生外源基因进入细胞（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出现错误，细胞内就会产生双链RNA，来阻止这些异常基因的表达）。

MiRNA：是内源性的，是一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。

成熟过程

SiRNA：直接来源是长链的dsRNA（通常为外源）；经过Dicer酶*切割形成双链siRNA,而且每个前体daRNA能够被切割成不定数量的siRNA片段。

MiRNA：在细胞核中转录的较大的pri-miRNA经由Drosha(一种RNAse Ⅲ酶)和Pasha（含有双链RNA结合区域）加工成为单链pre-miRNA；接着，发夹状、部分互补的pre-miRNA在细胞质中被Dicer*（一种RNAse Ⅲ酶）酶切割形成miRNA；在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性。

 

功能阶段

siRNA：它与RISC*（RNA诱导的沉默复合物，使用的AGO蛋白家族的成分为AGO2）结合，以RNAi途径行使功能，即通过与序列互补的靶标mRNA完全结合（与编码区结合），从而降解mRNA以达到抑制蛋白质翻译的目的；它通常用于沉默外源病毒、转座子活性。

MiRNA:它和RISC形成复合体(利用的AGO蛋白家族成员为AGO1)后与靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的3’端；它不会降解靶标mRNA，而只是阻止mRNA的翻译； miRNA能够调节与生长发育有关的基因。

 

注：RISC, RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。新的研究表明，与siRNA和miRNA结合的RISC复合物并不完全相同其中的AGO蛋白质有AGO1和AGO2之分。刚产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。从dsRNA引发RNAi的发生大致划分为三个阶段，即启动、剪切和扩增。

Dicer酶：新的研究表明siRNA成熟需要Dicer-2和R2D2蛋白，而miRNA则依赖Dicer1和它的伴侣loqs蛋白。

 

在研究人员的不懈努力之下，近期miRNA的基础研究以及应用研究方面取得了许多的重大进展……

 

第三回 MiRNA研究与疾病及研究进展

 

最近，miRNA常常在那些顶级杂志上露面，人类对它在生长发育中的调节功能以及与疾病关系的了解也一点一点地在增加。但是今天它好像有点心事重重的：“有人把我和疾病联系在一起，甚至把我叫做癌基因！但是，其实我的角色是多面的，如果利用的好，我可以帮助治疗绝症呢。我真希望你们能早日看清楚我的世界，这样就不会随便给我加罪名了，呜呜……”，miRNA抹抹眼泪说。

爱滋病毒

2001年，科学家发现一小段RNA可以关闭线虫体内的基因，这与早前发现的一些RNA小片段能使植物基因处于关闭状态的基因抑制现象十分相似；随后，又在老鼠和人的体细胞中发现了类似的RNA干扰现象。分子生物学家们认识到，这种RNA干扰对研究基因功能可能有非常重要的价值。
    2002年针对RNA的进一步研究表明，一些长度较短的小RNA能够对细胞和基因的很多行为进行控制，如打开、关闭多种基因，降解一些不需要的信使RNA。其中最令人兴奋的发现是，小RNA在细胞分裂过程中也能发挥重要的控制作用，可以指导个体的发育和分化。
    继发现长度较短的核糖核酸能调控基因表达之后，2003年科学家们继续专注于小RNA如何协调细胞习性的研究，正在探索如何利用小核糖核酸的本领来对付疾病。有关专家指出，这一领域的研究发现可以为操作干细胞分化提供新工具，并且可以用于探索治疗癌症等由于基因组错误所导致的疾病的新方法。
    目前认为miRNA在人体中有200多种类型。发表在6月2日的Nature杂志上的一项研究表明miRNA与感染的病毒的复制有关——之前认为这种分子只与内生的物质的调节有关，而于外源病毒的调节无关。因此，这一发现对miRNA的功能有了新的认识。
    2005年6月9日的《自然》杂志上的文章显示microRNA的活动模式能够被用于诊断癌症。研究人员Todd R. Golub和Robert Horvitz等人证明miRNA表达特征能用于划分人类癌症以及区别正常细胞和癌细胞。研究表明miRNA表达特征甚至能够鉴别出那些从外形上无法确定的癌细胞。发表在同期《自然》杂志上的第二篇文章表明一种特殊的miRNA束能够导致小鼠的淋巴瘤。由霍普金斯大学医学院的Joshua Mendell和同事发表在《自然》的第三篇文章显示一些miRNA与一种已知能导致人类癌症的基因相互协作。这让人怀疑miRNA可能充当一种新型的癌基因。通过确定出大多数常见癌症中表达的特殊miRNA以及分析它们对癌症发生和癌症基因的影响，这三项同期公布在《自然》杂志上的研究改变了癌症遗传学的前景。
    新的研究表明miRNA在从癌症、心脏病到艾滋病的各种疾病中起到一定的作用，而且有间接的证据表明如果将两个miRNA从人类基因组中删除就会发生白血病。据推测，MiRNA能够调节人类的三分之一的基因。有研究表明miRNA能够调节Ras癌基因、干细胞分化、脊椎动物肢体的形成等。
    在公布在《细胞》杂志上的研究中，洛克菲洛大学的Gaul和同事通过封闭在果蝇早期发育中起作用的46个miRNA，从而证明这些miRNA的大多数与发育息息相关。佛罗里达大学的研究人员发现当miRNA不能关闭特定基因时，小鼠就会长成畸形。刊登在7月《自然》杂志上的一项研究表明miRNA在心脏细胞的生长和分化过程中扮演极其重要的平衡角色。
    托马斯·杰斐逊大学杰斐逊医学院和Kimmel癌症中心的研究人员在PNAS上公布说，他们开发出了一种能用于在癌症和正常组织中寻找发生表达的miRNA以及表达方式的技术。他们开发出的miRNA芯片能够使他们检测到每种组织特有的miRNA表达模式。此前（2004年8月），杰斐逊的研究人员曾发现能够根据miRNA基因的表达模式来预测白血病。
    可以肯定，miRNA并非身体中的“超高级智能”分子，它虽然主要是作为调节性因子而存在，但它也必然是受到其他“暗物质”的调节。已经有研究发现一种叫做c-Myc的转录因子能调节miRNA。对miRNA的基础研究以及应用研究还在不断的向着纵深发展，我们期待有更多新的研究成果不断涌现并最终能促进人类健康事业的发展。
……….

第四回 RNA干扰

 

在过去的数年中，RNA干扰已经成为了研究人员手中的一把锋利的剑，并且这种技术在分子生物学的位置已经无法被替代。RNAi的研究和技术利用也是名副其实的“焦点中的焦点”。加之，它的作用主体是miRNA的兄弟siRNA，因此有必要将它单独加以介绍。

……

1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现21～25nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。随后，Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi 中的作用，这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。 

RNAi能够调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。RNAi的发现不仅提升了人们对RNA分子的认识，还大大推进基因功能的研究，更为各种类型的传染病和癌症提供了一种新的手段。近年来，有关RNAi研究成果令人眼花缭乱：人们利用RNAi途径来人为调节特定基因的表达以达到治疗遗传疾病甚至癌症的目的，而且已经有不少的成功信息公布。

…………

RNA干扰图解

尾声

 

我国对于RNA的研究曾经一度处于世界先进水平。在上世纪60年代，生物学领域刚刚开始了解核糖核酸的结构和功能，我们就进行了对RNA的研究。在1981年，我国出色地完成了一种小分子RNA———酵母丙氨酸tRNA的全合成，并且这种人工合成的RNA分子具有生物活性、完成了全部的碱基修饰，其产率和活性是世界上最高的。目前在RNA研究领域，国内一些实验室的工作也十分出色，研究水平是国际一流的，其中，上海生化所有关RNA的研究以及中山大学、武汉大学对于小RNA作用的研究等课题都有着卓越的成绩。

但是就目前整体情况来看，国内对RNA的研究的重视度还不够。虽然我国对于RNA的研究在某些方面曾领先世界，但目前总体来说还是十分薄弱的。但是，无论如何，我们期待中国的研究人员能够在这个领域的研究中放射出自己的光芒……（生物通杨淑娟）

 

 

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