转染巅峰之作——聚焦转染之第2站Roche[选购宝典]

生物通技术专评：始创于1896年的罗氏公司是以研究为导向的健康事业公司，总部位于瑞士巴塞尔。经过百年的历程，罗氏在众多领域已成为全球的领先者，比如说全球诊断领域排名第一；全球肿瘤领域排名第一；全球生物科技领域排名第二。罗氏公司应用科学部致力于生命科学领域产品的开发， 1998年收购德国宝灵曼（Boehringer Mannheim）公司后，Roche的产品涵盖了分子生物学，细胞学，免疫学，蛋白质组学，生物化学等多个研究领域。罗氏拥有PCR以及地高辛标记产品的全球专利，其DIG标记产品和细胞凋亡相关产品在业内享有极高的声誉。

一、独一无二的非脂质体型FuGENE 6 

    在转染方面，Roche的王牌产品FuGENE 6同样享有极佳的声誉。这个早在上世纪90年代中期由宝灵曼研发的王牌产品历时多年，依然是当今转染领域最好用的产品之一。在2004年度产品评选活动中FuGENE 6当选2004年度最值得信赖试剂产品，一位投票人在推荐理由中这样写到：“从未令我失望过。”确实，我自己以前也曾经试过在同样条件下用Clonfectin、Lipofectamine等几个转染试剂同时转染实验室里3种不同的细胞株，暂且不说实验的复杂程度和转染效率高低——单说这转染后报告基因表达效果，镜下检查FuGENE转染的细胞的绿色荧光都是最明亮，也是最多的。对于做表达的人来说，夫复何求？当然，这并不排除有细胞株的影响因素在内。

 特点 

    FuGENE 6是一种非脂质体型（non-liposomal）转染试剂，由专利配方的脂质混合体（lipids）和特定成分组成，通过加入的创新性组分，在增加核酸稳定性的同时，提高转染试剂－DNA复合体穿越细胞膜的效率；而这一过程速度的提高，预示了将整个转染过程对正常细胞生理功能的影响减到最小。这些是阳离子脂质转染试剂所不能达到的。转染试剂-DNA复合物可以直接加入细胞培养基中，有血清也不怕，而且转染前后都不需要更换培养基，不用去除转染试剂。FuGENE 6的细胞毒性很小，每一批产品出厂前都要经过严格质控，其中就包括在有血清存在且无需更换培养基的情况下， COS-1细胞与FuGENE6转染液或FuGENE6-DNA复合体温育26小时,PI染色后流式细胞仪分析细胞存活率必须在95%以上!

 适用的细胞系范围 

FuGENE 6的细胞毒性很小，可转染细胞系范围非常广泛，到目前为止已经超过750多种，范围之广无人能及，其中还包括90多种原代细胞和部分不易转染的细胞株/系。Roche的网站也做得十分贴心，如果你想查一下你手头的细胞株是否在这成功转染的列表中，可以访问（http://www.roche-applied-science.com/sis/fugene/），不单可以检索，还有详细的列表和Reference——如果不在其中，你可以根据其他成功转染的细胞信息来判断自己的是否值得去尝试。不管怎么说，FuGENE 6一般都可以满足你的需求。

 转染核酸范围和大小 

    FuGENE 6转染试剂不单可用于常规的DNA转染，还可用于长达10kb的大片段DNA, 寡聚核苷酸及核苷酸的高效转染，操作简便，不需要特殊的优化过程，大大减少试验中的操作步骤，适用于高通量检测方面的应用。但是，FuGENE 6 确乎不建议用在RNA或者siRNA转染上，在RNAi风行的今天确实是个遗憾。要用FuGENE 6 做RNAi，你只好用siRNA表达质粒载体了。

 操作流程 

    FuGENE 6的操作也是非常简便的（6孔板操作方案）

1. 培养细胞计数铺板在含血清，但不含抗生素的正常培养基中，到转染当天50%—80%汇片。

2. FuGENE 6在室温化冻后混匀后取3－6ul，用无血清培养基稀释到100ul，混匀孵育5分钟

3. 按照转染试剂:DNA(ug)比例3:1直接加入DNA，混匀并孵育15分钟以上。（孵育较长的时间，比如30min-60min，有助于提高某些细胞株的转染效率，但不超过2小时为宜）

4. 逐滴加入培养细胞的6孔板中，培养细胞1－3天检查结果。

    由于操作步骤简便，FuGENE 6 转染方案很容易放大，也很适合进行高通量筛选。

 用量和价格 

    价格和包装大小永远是实验室关注的重要因素。其实不单这个，每次的用量和成本，也就是一个包装可用的次数也应该是我们所关注的。FuGENE 6的价格1ml298美元，大概￥3000出头，千万别以为很贵，FuGENE 6的用量很省的，同样条件用量比别家少一大半以上－－你要知道，按照6孔板转染实验来计算，每次只需要3－6ul，1ml FuGENE 6足够做300次6孔板转染！而其他有些主流品牌起码要10－24ul/次6孔板 呢！这里要特别注意，FuGENE 6产品标注的可用转染次数是以6孔板为标准的，而有些品牌是以24孔板为基础，二者没有可比性，因为6孔板每孔面积比24孔板大5倍，所以，千万别以为1ml不如人家包装大啦，其实每次的成本是很节约的，能用的次数其实还要更多呢！在进口产品中这个价格相当实惠的！浓缩才是精华，再加上FuGENE 6的良好性能，这么多年来依然笑傲江湖，自然有它的道理。

 注意事项 

    FuGENE 6要求的转染时铺板密度在50％－80％间。由于转染试剂保存在80％乙醇中，FuGENE 6平时应该保存在-20度，在4度条件下可以只能稳定3周而不影响活性。由于有乙醇保护，反复化冻开盖不会导致氧化所以不影响活性，所以不要分装FuGENE 6！不均匀的黏附到新的管壁上反而影响试剂稳定！另外要注意使用前必须完全化冻到室温，并且要振荡1秒以充分混匀才可以取样稀释。稀释时要特别注意将tips插入无血清培养基中迅速吹打混匀，不要靠壁或者只在液面吹打，防止脂质成分平铺在培养基表面而影响复合物形成。千万不要先加转染试剂再加无血清培养基稀释，切记。FuGENE 6 很怕某些塑料表面的（只有Tips和原装管子那种塑料安全），可能里面的脂质会有反应吧。

    同样的，稀释用培养基必须是无血清培养基，从而保证转染试剂-DNA复合物形成。由于转染试剂可能会将抗生素带入细胞或者增加细胞通透性而影响细胞存活率，所以要求用不添加抗生素的培养基培养细胞，即使要用抗生素筛选，也要至少培养足够的时间让抗性基因表达后再换筛选培养基。细胞培养时血清的存在不影响转染效果，甚至，实验表明在有血清的培养基中转染而且不更换培养基，转化效率还好一点点。

    DNA最好的低内毒素的，因为某些细胞株对内毒素敏感。最好精确定量DNA，保证转染试剂(ul)和DNA(ug)比例3：1。Carrier DNA可免则免，如果非要加不可，那就多加些转染试剂，保证3:1的总DNA量。反正FuGENE 6 毒性小，多加些也不会毒死细胞的。某些细胞株如果表达不好或者转染效率不高还可以试试同时按比例增加转染试剂和DNA的量，往往有帮助。

二、一个强过一个的D家两姐妹

    DOTAP和DOSPER可算得上是久经考验的古董级的老产品了，操作简便，“内外兼修”的DOTAP作为单价阳离子脂质体转染试剂，主要特点是转染效率高，对细胞毒性小。DOTAP可以吸附带负电荷的DNA、 RNA、寡核苷酸、核蛋白以及其他的大分子转染到真核细胞中，对大多数细胞株的转染效率普遍要比传统的磷酸钙和DETA－葡聚糖的方法高5－100倍，而且，DOTAP除了可以进行体外操作外，还可以进行体内操作，因此目前已经被广泛应用于在非人类的动物模型基础上的基因治疗的研究中。此外，决定选择DOTAP的实验室人员还有一个原因，那就是DOTAP可以在混合物中有或没有血清的情况高效转染，这为一些需要血清“保护”的细胞株的转染提供了方便。

    DOTAP转染试剂固然好用，但是它的“妹妹”DOSPER转染试剂的设计更为巧妙。DOSPER试剂是经改进的多价阳离子脂质体转染试剂（polycationic lipid）。与DOTAP 不同，DOSPER的脂肪酸连接到了丙烷骨架的1、3位，这一特殊的结构可以使得DOSPER可以在较低的浓度下发挥作用 （DOTAP所需比例为5—10ug /ug DNA，DOSPER为2—10ug/ug DNA），从而减小对细胞本身的损伤，带来更好的转染试验结果，适用于某些不易转染的细胞株。可谓一半用量，双倍效果。

三、各有专攻的X兄弟

    RNA干扰技术已经成为了研究基因功能的有力工具，任何一个RNA interference实验的成功都有赖于转染试剂的选择，没有高效的转染，siRNA就不能有效的引发相应的细胞响应，会直接影响同一siRNA的抑制效果。为了弥补FuGENE 6 不能转染siRNA的遗憾，近期罗氏推出了X－tremeGENE siRNA Transfection Reagent，这种转染试剂专门针对siRNA的转染（包括siRNA直接疽约皊iRNA和表达质粒共同转染），比较于同类产品来说，主要优势一是有效的基因敲除（gene knockdown）效果（见下图），其次是其兼容性，因为X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent可以用于siRNA直接转染以及siRNA和表达质粒共同转染。第三就是它可以高效转染常见的哺乳动物的细胞株及部分不易转染的细胞株，而且对细胞的毒性和物理破损低，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent操作简便，反应前后无需更换介质。siRNA专用的转染产品经过专门优化，应该优于多功能转染试剂，而且产品具有很高的性价比，每个反应仅需要约0.40美金（1ml可做400次24孔板）。

> 90 % knockdown	70 - 90 % knockdown	60 - 70 % knockdown
COS-7	CHO-K1	Hep G2
HEK-293	HTC116	HT29
HEK-293T	MCF-7
HeLa
Huh-7
NIH 3T3
PC 3/PC 3 GFP

        除此之外，罗氏也提供了一种X-tremeGENE siRNA Dicer Kit，进一步方便了siRNA转染，这一试剂盒模拟了细胞RNAi的途径－－利用Dicer RNase将双链RNAs加工成小的21—24bp的小分子双链RNA断片段，体外生成d-siRNA，这样就可以在短时间内准备好更有效的siRNA用于转染。

    “术业有专攻”的X-tremeGENE Q2转染试剂则是专门针对Hela, K-562和Jurkat细胞而优化设计的，可以有效提高转染后蛋白表达，适用于在这几类细胞中大量蛋白表达研究。（生物通作者：王蕾  吴青）

  

一山更比一山高：聚焦转染之Merck篇

聚焦转染强中强：首站Invitrogen

聚焦转染：8大品牌转染试剂强中强