揭开RNAi上的神秘光环：应用生物发光报告基因优化RNAi[创新技巧]

（Promega 美国普洛麦格公司北京办事处供稿）

不是所有的siRNA在抑制哺乳动物靶基因时都同样有效，因此找到最有效抑制靶基因表达的siRNA的序列非常重要。 

    主要的RNAi的功能性介导物是双链、21-23个核苷酸长度的短干扰RNAs (siRNAs)。siRNAs与RNA诱导的沉默复合体（RISC）相互作用，在这里，siRNAs作为识别及剪切互补靶mRNA的模板。合成的siRNAs，或以短发夹RNAs (shRNAs)表达的siRNAs可以被导入细胞并用于RNAi的诱导。并非产生的指向靶基因的siRNA在抑制哺乳动物靶基因时都同样有效，因此，找到最有效抑制靶基因表达的siRNA序列非常重要。新的有效siRNA的设计原则已经被提出（1-3）。目前的筛选技术以半定量，费时的方法为基础，不能简单地用于快速、多个siRNA/shRNA序列的同时筛选。但是，随着RNAi领域的不断进展，并采用了更多的高通量手段，用于确定siRNA效应的快速定量的筛选方法正在被人们所需要。

RNAi 所需的方方面面

        有效的RNA干扰实验由两个基本步骤组成：1)找到有效的siRNA靶序列和2）在细胞中表达这些靶序列。在下面，我们详细叙述了完全满足这些步骤的三个载体系统。这些系统提供了简单快速的方法。psiCHECKTM载体(p2-6)提供了找到有效的siRNA靶序列的简单快速的方法。siSTRIKE™系统(p7-10)可用于快速简单地连接及表达寡聚核苷酸。siLentGene™-2载体系统(p11-14)提供了用于检测靶序列的快速盒式方法和将靶序列与载体系统连接的方法。

psiCHECK™载体的介绍

psiCHECK™载体提供了用于优化RNA干扰（RNAi）的快速的定量方法。该载体可以通过检测融合报告基因的活性来显示靶基因的表达变化。在psiCHECK™载体中海肾荧光素酶作为报告基因。插入的靶基因可以克隆到海肾荧光素酶翻译终止密码子下游的多克隆位点。针对靶基因的RNAi效应的启动导致包括海肾荧光素酶RNA序列在内的融合mRNA的剪切及后续的降解。RNA的降解导致海肾荧光素酶的活性下降。可以检测海肾荧光素酶活性的下降，同时可以用作检测RNAi对靶基因作用的一个方便指标。因此，psiCHECK™载体可以用于RNAi活性的定量检测并且可以轻松地用于高通量研究领域。

psiCHECK™载体可以用于理想的定量选择siRNA靶位点，而且可以用于高通量应用。psiCHECK™-1 (C8011)和psiCHECK™-2 (C8021)载体都含有合成的海肾荧光素酶(hRluc)报告基因，用以监测RNAi活性。为了有利于靶基因与合成的海肾荧光素酶报告基因的融合，在海肾荧光素酶翻译终止密码子的3’端加上了数个内切酶位点（例如：多克隆区域）。这些内切酶位点可以用于感兴趣的基因与海肾荧光素酶报告基因的融合。由于海肾荧光素酶翻译终止密码子的存在，将不会产生非融合蛋白。所以，当插入靶基因时无需保持功能性开放阅读框。另外，还可以用这种设计进行毒性基因或片段的分析。

我们推荐用psiCHECK™-1载体监测RNAi在活细胞中的活性。海肾荧光素酶活性的变化可以用EnduRen™活细胞底物(Cat. E6481)进行测定。这种方法可以连续监测细胞内的生物发光。可以连续2天监测海肾荧光素酶的表达而不会干扰细胞的正常生理状态。

psiCHECK™-2载体包含第二个报告基因-合成的萤火虫荧光素酶基因(hluc+), 是为终点裂解检测而设计的。海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性可以利用Dual-Luciferase® 报告检测系统(E1910) 或Dual-Glo™荧光素酶检测系统(E2920)进行测定。包含了萤火虫荧光素酶报告基因的psiCHECK™-2载体使得海肾荧光素酶的表达变化与萤火虫荧光素酶的表达变化标准化，使得该系统的可信度及重现性都得到了提高。

psiCHECK™载体如何发挥作用？
        图1是psiCHECK™载体作用机理的基本示意图。将感兴趣的基因克隆到位于合成的海肾荧光素酶基因及其翻译终止密码子3’端的多克隆区域。克隆后，将载体转入哺乳动物细胞系，海肾荧光素酶基因与靶基因的融合体得以转录。如果转录本是完整无损的，功能性的海肾荧光素酶即可被翻译。表达shRNA的载体或合成的siRNA可以同时共转化或顺序转化，这取决于你的实验设计。如果特异性的shRNA/siRNA有效地启动作用于靶RNA的RNAi过程，融合的海肾荧光素酶靶基因mRNA序列即被降解，导致海肾荧光素酶的活性下降。

图1.psiCHECK™载体的作用机理。

对psiCHECK™载体用途的评价
        为了评价这一筛选效应siRNA探针方法的有效性，我们使用位于每个载体多克隆区域的Sgf I 及Not I内切酶位点，将人p53 cDNA克隆到psiCHECK™-1和psiCHECK™-2载体上。内切酶位点位于海肾荧光素酶翻译终止密码子的3’端。我们也同时设计了5个不同的p53基因的shRNA。为确保所构建的含有shRNA的DNA能够针对p53基因的不同靶位点，我们使用了基本型siLentGene^TM -2 U6发夹克隆系统(C1860)。siLentGene^TM -2 U6发夹克隆系统可以使用一步法PCR得到含有U6启动子- shRNA序列（靶序列-环-反互补靶序列）-U6终止序列的DNA盒式结构。 转录的PCR片段可以直接转入哺乳动物细胞，用于有效预筛选shRNA靶序列，避免了费时的克隆步骤。
        为了评价上述方法，我们将含有p53 cDNA的psiCHECK^TM-2载体与表达p5 shRNA或无关shRNA（图2，点1-5）的线性DNA共转染HEK293T细胞。另外，我们用相对于有海肾荧光素酶完全互补的，或4个错配碱基的shRNA作为阳性对照。萤火虫及海肾荧光素酶信号使用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(E1980)产生。我们通过监测用萤火虫荧光素酶信号校正的海肾荧光素酶活性下降来确定不同的shRNA的效应。为确定从线形DNA表达的shRNA是否表现出同样的抑制作用，我们使用了基本型psiCHECK^TM-2载体。我们使用表达针对p53基因不同靶位点的shRNA载体重复实验。图2概括了这些数据。

       数据以针对不同靶位点的shRNA产生的海肾荧光素酶活性的（经过校正）抑制百分比表示。与非特异性对照相比，由针对海肾荧光素酶（按照操作手册TB329介绍的PCR方法得到）的线形DNA片段表达的shRNA表现出对校正后的海肾荧光素酶信号有43%的降低，并且通过将错配碱基导入靶序列可以消除这种抑制作用。5种针对p53的shRNA对海肾荧光素酶/ p53均有抑制作用；但是，抑制水平在56%（点2）-74%（点5）之间变动。将线形DNA片段克隆到psiCHECK^TM-2基本型载体后，可以观察到相似的抑制作用（兰色柱与红色柱相比）。在两种情况下，点4的p53表现出最高的抑制水平。但是，当用表达shRNA的载体转化细胞时，实际的抑制水平会更高。当psiCHECK^TM-2基本型载体表达针对p53靶位点4的shRNA时，可以检测到表达的海肾荧光素酶- p53蛋白有86%的降低。
        从这些数据中可以得出一些结论。首先，盒式系统及载体系统均表现出抑制效果。其次，通过PCR方法得到的DNA分子可以直接转化细胞以筛选合适的靶位点。再次，当将shRNA分子克隆到适合的载体（psiCHECK^TM-2基本型载体）时，表现出最高的抑制水平,提示理想的RNAi效应来自于较大的DNA载体结构。

图2. 使用psiCHECKTM -2载体选择p53基因的靶位点。图A. 将HEK293T细胞接种于96孔板，密度为3,000细胞/孔。利用Sgf I 及Not I内切酶位点，将人p53 cDNA克隆到psiCHECKTM-2载体。分别用每孔0.02μg psiCHECK™-2载体：p53及每孔0.08μg siLentGene™-2 U6发夹盒（兰色柱）或基本型psiCHECKTM-2载体（红色柱）转化细胞。CodeBreaker™siRNA转化试剂（E5052）用于转化DNA盒结构，TransFast™转化试剂（E2431）用于转化载体DNA。针对人p53的5个靶位点的shRNA作为对照。使用了针对海肾荧光素酶完全互补的或4个碱基错配的shRNA。将这些数据与用针对非特异性序列shRNA转化细胞的数据进比较。转化后48小时，使用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(Cat.#E1980)测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。数据以针对不同靶位点的shRNA产生的海肾荧光素酶活性（经过校正）抑制百分比表示。数据为12孔的平均值加减标准差。图B. 用HEK293T细胞测定抑制作用并用Western blot方法进行分析。单独用非特异序列处理细胞（泳道1），用克隆了非特异序列（泳道2）或p53靶位点4的psiCHECK™-2基本型载体处理细胞（泳道3）。瞬间检测于72小时后进行。

　

        为了验证上述方法，需要证明表达针对p53靶位点4的shRNA对内源p53蛋白的抑制作用。图2B给出了用表达针对非特异性序列（泳道2）与针对p53靶位点4（泳道3）的psiCHECK™-2基本型载体转化HEK293T细胞的Western blot分析结果。分析结果显示，在shRNA处理的细胞中，p53蛋白含量（用β-actin校正）的降低超过了80%。，确认了使用psiCHECK™载体得到的结果。

监测RNAi的动力学
        使用psiCHECK™载体中的海肾荧光素酶可以实时监测由RNAi介导的海肾荧光素酶在活细胞中的表达。图3显示用含有人p53 cDNA 的psiCHECK™-1载体与表达针对海肾荧光素酶或非特异性序列或p53的psiCHECK™-2基本型载体共转化的细胞中海肾荧光素酶活性的变化。于转化后17小时向培养孔中加入非裂解EnduRen™活细胞底物，监测其后26小时到41小时的相对光强度。我们观察到，在用针对非特异性序列shRNA转化的细胞中，海肾荧光素酶活性显著升高，而用针对海肾荧光素酶或p53靶位点4的shRNA转化的细胞中，海肾荧光素酶的表达只有轻微的升高。在用功能性shRNA转化的细胞中于41小时测到了对肾荧光素酶80%的抑制率。上述结果与图2中用终点分析法得到的抑制结果相一致。实验终了时，加入CellTiter-Glo®荧光细胞存活检测试剂(Cat.#G7570) 以确定细胞的生存状态。当海肾荧光素酶信号用每孔中的活细胞数校正后，抑制水平没有变化，但是，在信号变化方面，孔与孔之间表现出显著的降低（数据未列出）。

图3. 活细胞中海肾荧光素酶活性变化的测定。将HEK293T细胞接种于96孔板，密度为3,000细胞/孔。培养过夜后用转化混合物处理细胞。转化混合物的组成为：35μl 无血清培养基，0.3μl TransFast™转化试剂（E2431），每孔0.02μg psiCHECK™-1载体：p53及每孔0.08μg psiLentGene™-2基本型载体。本实验中psiLentGene™-2基本型载体表达针对p53，海肾荧光素酶或非特异序列（阴性对照）的shRNA。培养1小时后，向每孔加入100μl含血清培养基。转化后17小时，加入EnduRenTM活细胞底物(E6481)，使其终浓度为60μM，并监测海肾荧光素酶活性。

对多个目标筛选多个shRNA
        我们分析了由一组caspase基因RNAi引起的沉默效应以确定本系统在鉴定其它基因的有效RNAi位点方面的可用性。我们使用siLentGene™-2 U6发夹克隆系统提供的快速PCR方法，得到了shRNA。用针对caspase不同靶位点的PCR产物与含有caspase基因编码cDNA 的psiCHECK™-2载体共转化细胞。转化后48小时测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶的活性。柱状数据列于表4。图A，用克隆了caspase-8 cDNA的psiCHECK™-2载体及表达针对caspase-3、caspase-7、caspase-8 及caspase-9的不同靶位点的DNA盒共转化Hela细胞。数据显示，当与psiCHECK™-2: caspase-8载体共转化时，只有含有针对caspase-8靶序列的一个shRNA（位点3）表现出对海肾荧光素酶活性明显的抑制作用。针对不同caspase（例如：caspase-3，7或9）靶位点的shRNA对海肾荧光素酶活性未表现出明显的抑制作用。

图4。 多个候选shRNA的筛选。图A. 将caspase-8 cDNA克隆到psiCHECK™-2基本型载体的多克隆区域作为psiCHECK™-2：caspase-8载体。设计3个特异性抑制caspase-3，caspase-7，caspase-8和caspase-9的候选shRNA。siLentGene™-2盒表达的shRNA通过PCR单独获得。用psiCHECK™-2：caspase-8载体与针对不同靶位点的siLentGene™-2 DNA盒共转化Hela细胞。转化后48小时，用Dual-Luciferase® 报告1000检测系统(Cat.#E1980)测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。海肾荧光素酶相对光强度单位用表达的萤火虫荧光素酶活性校正。图B. 用克隆了caspase-3，7，8 或caspase-9的psiCHECK™-2载体与表达针对相应caspase靶位点shRNA的siLentGene™-2盒共转化Hela细胞。转化后48小时，用图A. 所描述的方法测定海肾荧光素酶及萤火虫荧光素酶活性。数据用抑制百分比表示。非特异shRNA转化细胞中校正后的海肾荧光素酶活性与针对不同caspase和不同靶位点的shRNA转化细胞中校正后的海肾荧光素酶活性的比值即为抑制百分比。

    用含有相应caspase（例如caspase-3）cDNA的psiCHECK™-2载体与表达针对相同caspase（本例中为caspase-3）多个靶序列shRNA的DNA共转化的数据示于图4，B。数据以抑制海肾荧光素酶活性的百分比来表示，而海肾荧光素酶活性通过转化了非特异性shRNA的细胞中的海肾荧光素酶活性与转化了不同靶位点的shRNA的细胞中的海肾荧光素酶活性的比值来校正。所有检测的caspase-3靶序列均未显示出对海肾荧光素酶活性的明显抑制作用。由DNA片段表达的，对caspase-3，caspase-8 和caspase-9最有效位点表现出46%-64%的抑制作用，但是基于我们以前有关海肾荧光素酶及p53靶位点分析的数据，如果将DNA片段克隆到合适的载体，抑制水平将会有所升高。

结 论
        为了在鉴定及定量RNAi启动因子（如shRNA或siRNA）方面为研究者提供帮助，Promega公司开发了psiCHECK™载体系统。一旦感兴趣的基因被克隆到所选择的psiCHECK™载体，就可以利用定量并快速的方法来优化RNA干扰。psiCHECK™-1载体与EnduRen™活细胞底物一同使用可以连续监测活细胞内显示RNAi的海肾荧光素酶表达的降低。由于包含了萤火虫荧光素酶表达盒，对来自psiCHECK™-2载体的海肾荧光素酶表达结果可以进行校正，因此减少了实验及转化中的偏差，得到可信，重复性好的结果。