功能分类基因芯片与表达谱基因芯片之比较[创新技巧]

引言：

    基因表达谱常被称为是某一生理/病理现象的“分子图像”。这类复杂的“分子图像”，可用于同时检测成千上万个基因的表达水平，再经专门的计算机软件解读出来。研究人员通过比较源于不同病理条件下的“分子图像”的结果，可以识别出引发癌症等复杂疾病的标志物(Marker)。目前，这些标志基因(Marker genes)还有待于大量工作对其作进一步验证。许多科研人员已把注意力投向密度相对较低的功能分类基因芯片(focused DNA microarray)。因为，如果研究对象是某一生物学通路的基因，使用针对该类基因的功能分类基因芯片比使用高密度表达谱芯片更加有效便利。这种将微列阵技术与特定生物学通路（specific biological pathways）最新知识有机结合而制成的功能分类基因芯片,可以大大缩短发现诊治各种疾病的生物学标志物(biomarkers)的时间。

表达谱芯片：整个基因表达谱的分子图像。

    自从90年代中期DNA微列阵芯片技术开始引起广泛注意以来，DNA片段以及不同长度的寡核苷酸被尝试点样在尼龙膜、玻片、塑片、硅片及合金片上。有成千上万个点的表达谱芯片，也有百来个点的功能分类基因芯片，但是两种芯片都是用于摄取活细胞或组织标本的“分子图像”，然后对不同病理生理条件下所摄取的图像进行平行表达比较，从而人们可在更深的水平上认识器官的生理或病理现象。

    当研究的对象是细胞中mRNA的稳定水平，这个分子图像的摄取过程就叫基因表达谱检测。在美国科学杂志1999年10月发表的文章中，T.R.Golub,E.S Lander[1]从表达谱芯片的6817个基因中发现了50个基因对急性白血病的分类与诊治有着重要意义。这一组基因不仅可以用于区分急性骨髓性白血病与原始淋巴细胞白血病，还解决了传统病理研究工具所无法解决的诊断难题。这一研究发现的意义不仅在于它将基因芯片技术引入到临床科研中来，以帮助肿瘤的分类，还在于这种技术可以预测某些化学疗法与荷尔蒙疗法的作用，监测恶性癌前病变与检测微生物机制[2]。但是，在临床疾病研究中广泛使用表达谱芯片检测几千个基因是不现实的，研究人员希望芯片上被研究的基因数目能够减少，因为由许多与研究对象无关的基因所提供的数据会对分析与研究对象有关的基因产生干扰，提供无用(inconsequential) [3]的或错误(detrimental)的信息[4]。

功能分类芯片：各类生物学通路的分子图像。

    剔除基因芯片上对研究对象毫无意义的基因正是功能分类基因芯片与表达谱基因芯片的本质区别。有时，表达谱基因芯片的包罗万象的特征会受到这样的批评：如大海捞针式的缺乏科学假设为前提的实验方案[5]。然而，功能分类基因芯片上通常只有几百个或更少的基因，这些基因包括了那些与研究对象有确定关系的基因，或至少是与研究对象的关系有待考证的基因。不同于研究整个基因表达谱，使用功能分类基因芯片的研究人员的实验是建立在现有科学假设的基础上的。

    毫无疑问，表达谱芯片提供了一种前所未有的研究基因相互关系的先进技术，这种技术自然成为了设计功能分类基因芯片的技术来源之一。在前述Lander的对急性白血病分类的研究中[6]，科学家们根据表达谱芯片结果的选择了70个基因并制成低密度基因芯片。这个由70个功能明确的基因制成的芯片获得了极大的关注，因为它是欧美第一个以芯片技术为基础的临床诊断产品。但是，这并不是说功能分类基因芯片的设计必然依赖于表达谱基因芯片的结果。实际上，功能分类基因芯片的设计通常是基于研究课题的实际需要或是对特定基因组的现有知识。

按实验课题需要设计的功能分类芯片：

    按实验课题需要设计的芯片通常也称作“定制芯片”（customized array）。

    因为点在芯片上的基因完全由特定研究课题所决定。例如，为了研究细胞类型和供体特异性转录对干扰素的反应，J.Schlaak和同事们设计了一个定制芯片[7]。在这个芯片上包括了已知的（即已有文献记载的）会受干扰素影响的基因，也包括了那些与细胞增殖、免疫反应及与各种细胞因子反应相关的基因（尽管在他们研究的各种细胞中，这些基因对干扰素的直接反应还没有文献记载）。这种芯片便是一种可用于发现新的细胞类型和供体特异性转录对干扰素反应的有效手段。大多数定制芯片是由研究人员自己设计并制作出来的，或者是由一些研究机构的芯片中心制作出来的。目前很少有商业机构有能力以经济有效的价格提供定制芯片服务。

按现有基因知识设计的功能分类芯片：

    按现有基因知识设计的芯片也被称为是“预制芯片”(pre-printed DNA array)。

    这种芯片由厂家按照各类研究人员的普遍需求成批生产。其用途可以很容易地从他们的名称中分辨出来。比如：一个细胞凋亡基因芯片包括了那些会引起细胞凋亡的基因，通过这类芯片可以检测组织或细胞标本中与细胞凋亡相关的基因表达量的变化。您可以通过google搜索引擎 http://www.google.com。（只需键入”apoptosis arrays”）找到提供细胞凋亡基因芯片的公司列表。我们最近一次搜索的结果是：Superarray, BD clontech, R&D Systems, Sigma-Genosys。

    大多数预制芯片是根据对某一生物学过程和通路的知识而设计的。在互联网和生物信息学的推动下，特别是如Pub Med ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed ) 和Gene Ontology (GO) Project（ http://www.geneontology.org/doc/index.shtml ）这类搜索引擎的出现，使收集有关功能分类基因芯片所需要的知识越来越容易了。每张功能分类基因芯片上的所有入选基因几乎都与某一明确的信号通路直接相关， 并且通常都可以找到论证其入选资格的科学文献。有时通过精巧的实验设计，采用几个功能分类芯片便可以达到使用高通量表达谱芯片的同样目的，为您节省大量的时间和金钱，从而达到事半功倍的效果。

    另外，有些预制的功能分类基因芯片是为某一研究方向而设计的，包含了与这一研究方向相关的多个生物学通路的基因。例如：一个癌症基因芯片往往包括了几个与癌症相关的生物学通路上的基因，如肿瘤形成、肿瘤转移等。还有一种功能分类基因芯片的设计原则是按照功能基因组来选择基因的。例如，选择所有与炎症细胞因子相关的基因（其中包括了细胞色素P450家族基因组，ATP结合盒转运器（ABC）和其它类别的基因）放在同一张芯片上用于检测炎症，研究自身免疫疾病和进行药物代谢与药物耐受的研究[8，9]。

    由于对细胞信号转导途径重要意义的认识，美国高科技协会（AAAS）和科学杂志专门建立了一个“知识库”（Knowledge environment Http://stke.sciencemag.org/index.dtl ）以便最大限度的帮助读者提高收集、理解和吸收有关细胞变化规律的知识的效率。在当今对信号转导途径认识的基础上，美国SuperArray Bioscience Corporation 已经设计出了一系列“信号通路发现者”（Pathway Finder）基因芯片，用于帮助研究人员在信号转导途径这一异常复杂的生物学网络中探索遨游。其中有一种信号转导通路发现者芯片(Signal Transduction Pathway Finder Gene Array 货号;HS-008)可以同时监测18条信号通路。例如：为了探测MAP30（一种抗HIV的试剂）对AIDS相关的淋巴瘤细胞的基因表达的影响，S.Lee-Hung等研究人员选用了SuperArray公司的一个与8个信号通路有关的通路发现者基因芯片。通过这个芯片的检测，他们很快发现其中三个信号通路受到MAP30的影响最大，它们是：细胞凋亡、细胞周期和细胞因子。在2001年发表的文章中[10]，S.Lee-Hung公布了他们的发现： MAP30可以调控那些与细胞增殖，肿瘤形成和细胞凋亡有关的基因。

放大的分子图像： 基因芯片技术的另一发展方向。

    在照像技术大众化之前，为自己制作一张肖像不是一件简单的事。因为画师的主观性和对绘画技巧的过分表现都可能会使您在画布上的形象失真。从许多方面来讲，现在的基因芯片技术有点类似于过去的画像，因为尚缺乏可供研究人员共同参照的客观标准[11，12]，其结果的可靠性仍然受到不少人的质疑[13]。根据Dana –Farber癌症研究中心和麻省whitehead 生物学研究中心的T.Golub的观点[6]，微列阵芯片技术正在经历一场快速的“自然进化过程”(natural evolution)。目前，我们用表达谱芯片所获取的分子图像还十分“模糊”，因为不同实验平台之前的区别如此之大, 以至于人们无法在没有其它独立验证方法的情况下把微列阵芯片的结果作为可以自圆其说(self-sufficient)的科学事实来接受[14]。然而，功能分类基因芯片采用了预先经过科学验证的标准和知识为基础，这对于研究的准确可靠性是十分有益的。因此,我们可以把功能分类基因芯片的结果比作对基因图谱进行局部“放大”（infocus）的分子图像。通过这一技术，基因技术革命或许会在生物医药和临床诊治研究中发挥更大的做用。

重要生物学通路研究工具

    功能分类基因芯片因其对生物学通路的高针对性被视为生物学通路的重要研究工具之一。“生物学通路”（pathway-centric）研究工具是指针对研究某一生物学通路或者基因组特异性而设计的生命科学研究工具。这类工具由于是根据相关基因的现有知识组合而成的,可以使研究人员在研究中不需要再花费时间精确鉴别与此疾病或者细胞功能相关的基因是哪些。美国SuperArray公司开发的“生物学通路”研究工具包括针对各个生物学重要通路或者基因组而设立的三个产品技术平台：功能分类基因芯片，RT-PCR试剂盒和siRNA试剂盒。以功能分类基因芯片为核心，三种技术交叉使用可大大方便实验结果的验证和开展更深入的研究。

    例如，利用SuperArray公司的“生物学通路”研究工具，研究者可以快速拟定并进行下列有关细胞凋亡的实验：

1. 用人细胞凋亡基因芯片检测并比较正常样本和疾病样本中与细胞凋亡相关基因的改变。

2. 用单基因（Single Gene）PCR试剂盒验证某细胞凋亡相关基因的表达变化或者用多基因（MultiGene-12）PCR试剂盒验证一个基因家族的表达变化。 

3. 用siRNA试剂盒逐个敲除与细胞凋亡相关基因的表达或者用新推出的siRNA阵列板对某一个基因家族进行敲除。 

4. 再用人细胞凋亡基因芯片检测敲除某基因后细胞凋亡相关基因的表达变化。

图1 三种研究工具互相辅助进行的基因研究方法可加速我们对重要疾病或者细胞功能通路的研究，大大简化研究方案的设计，加快实验进程，并降低实验的整体费用[15]。

    以下通过功能分类基因芯片和siRNA技术结合证明TBL1/TBLR1参与NFkB信号通路[16]的实验是生物学通路研究工具在科研中应用的一个很好的例子：

    TBL1/TBLR1作为两种F box/WD-40因子，最初被认为是N-CoR辅抑制物复合体的组成部分。然而， 在Perissi和他的同事们发表在Cell上的文章中，他们发现核受体介导的转录激活需要这两种因子的参与。在他们的实验中，作者用SuperArray公司的NFkB信号通路基因芯片（货号：MM-016）分析NFkB转录激活中是否需要TBL1/TBLR1的参与。RNA样品取自500个实验细胞，实验显示， 当用合成的基因特异性siRNA将TBL1或者TBLR1敲除后，由TNFa 刺激导致的所有NFkB靶基因的激活便不再发生。

图 2：用小鼠NFkB信号通路基因芯片所得到的基因表达状况之比较。
样品A来自未经处理的HUVEC细胞
样品B来自经TNFa刺激的 HUVEC细胞
样品C来自经TNFa刺激又经Tbl1 siRNA作用的HUVEC细胞
样品D来自经TNFa刺激又经 Tb1R1 siRNA作用的HUVEC细胞

References: 
1. Golub, T.R., et al., Molecular Classification of Cancer: Class Discovery and Class Prediction by Gene Expression Monitoring. Science, 1999. 286(5439): p. 531-537. 
2. Snijders, A.M., et al., Microarray techniques in pathology: tool or toy? Mol Pathol, 2000. 53(6): p. 289-294. 
3. Wooster, R., Cancer classification with DNA microarrays: is less more? Trends in Genetics, 2000. 16(8): p. 327-329. 
4. Draghici, S., et al., Onto-Tools, the toolkit of the modern biologist: Onto-Express, Onto-Compare, Onto-Design and Onto-Translate. Nucl. Acids. Res., 2003. 31(13): p. 3775-3781. 
5. Schena, M., Microarray biochip technology. 2000, Natick, MA: Eaton Pub. xiv, 298 , 32 of plates
6. Branca, M., GENETICS AND MEDICINE: Putting Gene Arrays to the Test. Science, 2003. 300(5617): p. 238. 
7. Schlaak, J.F., et al., Cell-type and Donor-specific Transcriptional Responses to Interferon-alpha . USE OF CUSTOMIZED GENE ARRAYS. J. Biol. Chem., 2002. 277(51): p. 49428-49437. 
8. Huang, Y. and W. Sadee, Drug sensitivity and resistance genes in cancer chemotherapy: a chemogenomics approach. Drug Discov Today, 2003. 8(8): p. 356-63. 
9. Huang, Y., et al., Expression of transporter genes identified chemo-sensitivity and -resistance markers in human cancer cells. Proceedings of the American Association of Cancer Research, 2003. 44(2nd ed.): p. 797. 
10. Sun, Y., et al., Anti-HIV agent MAP30 modulates the expression profile of viral and cellular genes for proliferation and apoptosis in AIDS-related lymphoma cells infected with Kaposi’s sarcoma-associated virus. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 287(4): p. 983-94. 
11. Brazma, A., et al., Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet, 2001. 29(4): p. 365-71. 
12. Bowtell, D. and J. Sambrook, DNA microarrays : a molecular cloning manual. 2003, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. xxiii, 712. 
13. Goodman, N., Microarrays: Hazardous to Your Science. Genome Technology, 2003. 
14. Chuaqui, R.F., et al., Post-analysis follow-up and validation of microarray experiments. Nat Genet, 2002. 32 Suppl: p. 509-14. 
15．What Pathway-Centric Tools and Technology Can do for you? SuperArray Corporation Newsletter
16. Perissi V, Aggarwal A, Glass CK, Rose DW and Rosenfeld MG. (2004) A Corepressor/Coactivator Exchange Complex Required for Transcriptional Activation by Nuclear Receptors and Other Regulated Transcription Factors. Cell 116, 511-526