提高RT-PCR的灵敏度和产物长度[创新技巧]

摘要

    RT－PCR 已经成为研究者确定感兴趣的器官、组织或细胞中mRNA 转录本出现、结构和表达水平的基本方法。RT－PCR的基本步骤包括：首先对样品中出现的所有mRNA 合成一个cDNA拷贝，接着扩增感兴趣的基因。因为两个步骤中使用的反应缓冲液不能兼容，所以这两个步骤（RT 和PCR）通常分别进行。即使有些试剂盒能将两个步骤合而为一，但是同样因为上述的缓冲液不兼容性，极大地限制了检测灵敏度。Eppendorf 设计了一个含有全新化学物质的新试剂盒，使一步法RT－PCR 更加有效，在两步法实验中可以获得更高的灵敏度。本文将对新试剂盒的表现进行检验。

简介

    逆转录（RT）以及随后进行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得最广泛的技术之一。如果需要平行分析多个RNA 样品，首选方法为一步法RT－PCR。如果要扩增困难目标片段或从单一cDNA 池中扩增多重目标片段则会选择两步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系统适用于各种RT－PCR 应用。它含有一种全新的重组逆转录酶和一种具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反应缓冲液能够自动调节镁离子浓度，因此这一重要成分的浓度无需优化。这种自我调节的效果是通过对镁离子的弱螯合作用来实现的。如果镁离子浓度过高，螯合剂会与过剩的镁离子结合，如果反应（Taq 或DNA）需要镁离子，镁离子就会被释放出来。这种创新技术提高了cMaster RTplusPCR的灵敏度和特异性。使cMaster RTplusPCR试剂盒既能进行一步法，又能进行两步法RT－PCR，而且具有很大的动力学检测范围，能扩增得到的PCR产物长度范围也很大（一步法反应最长可扩增5.3 kb片段；两步法方案最长能扩增12.3 kb 片段）。

下面的实验可以展示该试剂盒在不同应用中的表现。
    实验1关注新试剂盒在一步法RT－PCR 中卓越的灵敏度。而在一步法应用中，最重要的因素就是能够采用尽可能少的目标材料进行有效工作。

    实验2显示应用一步法方案进行长距离RT－PCR 不再是个难题。试剂盒中创新的缓冲液能同时保证逆转录酶和高保真酶混合物都具有最佳延伸性。

    本系统提供的两步法RT－PCR 备选程序适用的模板范围很广。实验3描述了对不同模板的扩增情况。这个新的系统能为所有的RT目标提供全面解决方案，不论需要扩增的片段是中等长度还是极长，不同来源的总RNA 中转录本是低丰度还是高丰度。

材料和方法

Eppendorf cMaster RTplusPCR系统
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic试剂盒
所有的PCR反应均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR仪上进行。

实验1：一步法灵敏度检测RT－PCR 
扩增目标：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。
模板RNA：从人HELA细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度从1μg递减至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系统，标准一步法RT－PCR方案。1:10 稀释RTplusPCR 缓冲液，镁离子终浓度2.5 mM，反应总体积50μl
 循环参数：

循环	步骤	温度	时间	描述
1x	1	50°C	30分钟	逆转录
1x	2	94°C	3分钟	初始变性
40x  {	3	94°C	15秒	模版变性
	4	68°C	45秒	引物退火/延伸

结果

cMaster RTplusPCR 系统显示出一种依赖于模板RNA 量的宽广的产物产量动力学范围。能从低至10 pg 的HELA 总RNA中检测到α微管蛋白mRNA。

　

实验2：一步法扩增长片段RT－PCR 

扩增目标：5.3 kb 的人结节性脑硬化因子（hTSF）mRNA 片段。
模板RNA：从人HELA 细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度为100 ng 和10 ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒，针对长模板的特殊RT－PCR 方案。

设置一步法RT－PCR 反应。

成分	50μl RT－PCR反应体积	反应成分的终浓度
不含RNA 酶的水	2.5μl
dNTP 混合物 每种dNTP 浓度均为10 mM	2.5μl	500μM
hTSF正向引物	1.0μl	200 nM
hTSF反向引物	1.0μl	200 nM
总HELA RNA	3.0μl	每个反应中中含10ng－100ng
MasterMix 1	10.0μl
不含RNA 酶的水	34.0μl
含镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液	5.0μl	1×；2.5 mM 镁离子
cMaster RT 酶	0.5μl	0.15U /μl
cMaster PCR 酶混合物	0.5μl	0.05U /μl
MasterMix 2	40.0μl

 循环程序参数

循环	步骤	温度	时间	描述
1x	1	65°C	5分钟	初始RNA变性
1x	2	42°C	60分钟	逆转录
1x	3	93°C	3分钟	初始变性
35x  {	4	94°C	15秒	模版变性
	5	59°C	30秒	引物退火
	6	68°C	5.5分钟	引物退火

结果

如图2 所示，应用一步法RT－PCR 方法，可以从100 ng 和10 ng 总RNA 中检测到5.3 kb 的hTSF PCR 产物。这个PCR 反应非常困难，大多数RT－PCR 试剂盒生产厂家从未发布过应用一步法方案，有效扩增类似长度模板的结果。相反，Eppendorf 试剂盒能稳定可靠地从10 ng HELA 细胞RNA 中扩增该产物。

　

实验3：两步法RT－PCR 

两步法RT－PCR 的扩增目标：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA 片段
1.3kb 的（鼠和人）肿瘤坏死因子受体（TNFR1）mRNA 片段
5.3 kb 的人结节性脑硬化因子（hTSF）mRNA 片段
12.3 kb 的鼠动力蛋白mRNA 片段

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒，采用产品说明书中的针对普通长度模板和较长模板的两步法RT－PCR 程序。所有的逆转录反应均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物为引物。

设置第一步RT 反应

成分	以Oligo（dT）20 为引物进行逆转录	反应成分的终浓度
不含RNA 酶的水	加至MasterMix 1 总体积为10μl
dNTP 混合物 每种dNTP 浓度均为10 mM	1.0μl	1mM
Oligo（dT）20 引物（0.5μg /μl）	1.0μl	25ng/μl
模版RNA
HELA (350ng/μl)	3.0μl	}  1μg总RNA
A细胞(1 μg/μl)	1.0μl
L细胞(220ng/μl)	4.5μl
McCoy细胞(135ng/μl)	7.0μl
MasterMix 1	10.0μl
不含RNA 酶的水	5.0μl
含镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液	4.0μl	2×；5 mM 镁离子
RTplusPCR 反应缓冲液
cMaster RT 酶	1μl	0.75U /μl
MasterMix 2	10.0μl

设置第二步PCR 反应

成分	普通PCR（微管蛋白TNFR1）	长片段（动力蛋白，hTSF）	反应成分终浓度
不含RNA 酶的水	7.0μl	6.0μl
正向引物	1.0μl	1.0μl	0.2μM
反向引物	1.0μl	1.0μl	0.2μM
第一步逆转录反应产物	1.0μl	2.0μl	N / A
MasterMix 3	10.0μl	10.0μl
不含RNA 酶的水	33.6μl	32.0μl
含25 mM 镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液	5.0μl	-	1×；2.5 mM 镁离子
含25 mM 镁离子的 10×Tuning 反应缓冲液	－	5.0μl	1×；2.5 mM 镁离子
dNTP 混合物/ 每种dNTP 浓度均为10 mM	1.0μl	2.5μl	200μM（500μM）
cMaster PCR 酶混合物	0.4μl（2U）	0.5μl（2.5U）	0.04－0.05 U /μl
MasterMix 4	40.0μl	40.0μl

 

RT反应条件

步骤	温度	时间	描述
1	65°C	5分钟	初始模版变性
2	0°C	5分钟	冷却变性模版
3	42°C	60分钟	第一链cDNA合成
4	-20°C	直到PCR	引物退火/延伸

注：动力蛋白的逆转录孵育时间延长至90 分钟。

循环	步骤	温度	时间	描述
1x	1	94°C	3分钟	初始变性
35x  {	2	94°C	15秒	模版变性
	3	68°C	40s/60s	引物退火/延伸

* —— 微管蛋白
** —— TNFR1

hTSF 和动力蛋白的三步循环方案

循环	步骤	温度	时间	描述
1x	1	93°C	3分钟	初始模版变性
35x {	2	93°C	15秒	模版变性
	3	56°C	30秒	引物退火
	4	68°C	12分钟	引物延伸

　

不同大小目的片段所采用的延伸时间和退火温度

目的片段	微管蛋白	TNFR1	hTSF	动力蛋白
延伸时间（PCR）	40秒	1分钟	5.5 分钟	12 分钟
退火温度	68℃	68℃	59℃	56℃
退火时间	—	—	30 秒	30 秒
每循环增加时间	—	—	—	20 秒

 结果

对5 种不同表达水平的基因进行RT－PCR。为了得到最高的灵敏度，RT 和PCR 反应分开进行。如图3 所示，对于α微管蛋白和TNFR1，我们可以应用两步法RT－PCR 方法并将退火和延伸步骤合并为进行一次68℃ 孵育。如图3 所示，无论片段长度大小和拷贝数高低，所有反应都可以顺利进行。即使对于动力蛋白这种特别长（达12.3 kb）的极端稀有转录本，用cMaster RTplusPCR 系统也能够进行有效扩增，而且结果具有极佳的重复性，表明即使对于困难的RT－PCR 反应， Eppendorf 试剂盒也能获得可靠结果。

　

讨论

    cMaster RT 系统是为了给所有的RT 和RT－PCR 应用提供最大的灵活性而设计的。该试剂盒结合了重组的同二聚体病毒逆转录酶和独特的RTplusPCR 反应缓冲液系统，可以在较宽的温度范围（37℃－60℃）和0.2kb-12.5kb产物大小范围内进行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具热稳定性DNA 聚合酶活性，校正功能辅助的保真性和高延伸效率。应用于一步法中，可以灵敏地检测到极少量的总RNA 并扩增出长达5.3 kb的cDNA（参见图1 和图2） 两步法方案可以从RT 反应中扩增多个目的cDNA，PCR产物的片段长度可增加至12.3 kb（参见图3） 其他的扩展应用：系统的逆转录部分即cMaster RT 可以与任何PCR系统合用或者为其他下游应用如杂交实验合成cDNA 探针。