PCR产物直接转染细胞并转录siRNA诱导RNAi[新品推荐]

    对于哺乳动物细胞进行的RNAi实验，如何制备最适的siRNA是一个关键问题。目前制备siRNA的方法主要有：化学合成siRNA；体外转录制备siRNA；体外转录合成长双链RNA后用Dicer或者RNAseIII降解为siRNA库；siRNA表达载体在细胞体内生成siRNAs；PCR扩增siRNA表达框并直接用于转染。生物通在此前陆续介绍了前面4种方法，在这里我们来介绍最后一种方法——PCR扩增siRNA表达框，这也是一种很巧妙的方法，不但避免了复杂的RNA操作，而且不需要经过载体克隆、筛选和测序的步骤，只要将PCR产物转染到细胞中就可以进行RNAi实验和对不同的siRNA进行快速筛选！

优点：

• 通过PCR的方法制备可以表达siRNA的表达框，无需克隆，无需质粒纯化，也无需测序

• 在克隆进一个质粒前快速检测不同的siRNA序列和启动子的效率

• 在DNA水平上操作，避免体外合成RNA的种种不便

原理：

    siRNA表达框（siRNA expression cassettes，SECs)是一段PCR产物，包含启动子、发夹结构的siRNA模版（hairpin siRNA template）和终止序列，当PCR产物转染到细胞后，发夹结构的siRNA模版被转录，得到的发夹siRNA被加工并诱导特异的基因表达沉默。

    Silencer Express Kits 能够通过PCR的方法，简单制备带有人源H1或者U6启动子或者鼠源U6启动子的siRNA表达框（siRNA expression cassettes，SECs)，从而是RNAi实验变得异常简单。全部操作在DNA水平进行，避免了操作RNA的繁琐要求。

    siRNA表达载体需要经过克隆和测序，这可能需要1—2周的时间，如果已知siRNA有效，这番克隆的值得的，因为只有载体上的siRNA才能持续表达，但是如果有很多siRNA筛选，这么艰苦的克隆和测序就非常费时费力了。siRNA表达载体由于Size比较大，转染效率不高，而且细胞必须在有抗生素压力的条件下培养来维持siRNA的表达，对于一些敏感细胞就无能为力了。而SECs能够在一天的时间内制备，转染方便高效，无需抗生素筛选，无需克隆和测序，能有效的节约时间，因而成为一种非常有效的筛选siRNA的工具，或者是鉴定不同启动子和不同的siRNA序列之间最佳搭配的筛选工具。应该说SECs是siRNA表达载体的完美补充，通过在SECs两端添加酶切位点，在实验中找到的高效SECs就能够立即被克隆到质粒中，从而得到siRNA表达载体，从而进行稳定和长时间的RNAi研究。

简单而快速的制备流程

1.设计并合成1—2段编码siRNA序列的寡核苷酸

2.作为引物扩增含有RNA PolIII启动子的DNA模版

3.PCR扩增全长，PCR产物纯化并用于转染细胞。

只要简单的3步骤就可以完成实验！

寻找最适合的启动子

    常用的启动子有3种：人源的U6启动子和H1启动子，以及鼠源的U6启动子，由于实验中采用的细胞株各不相同，即使是同一种siRNA，采用不同的启动子得到的效果可能相差很远。另外也潜在siRNA序列和启动子序列之间相互作用影响转录效果的可能。专家建议：至少检测2个以上的不同启动子，分别转染细胞，以找到最适合所设计的siRNA和所选细胞株的启动子，从而得到更高水平的基因沉默的结果。由于每个siRNA模版可以和3种不同的启动子搭配，采用SECs这种方法可以快速而有效的检测：对于不同的siRNA和不同的细胞株，哪一种启动子是最适合的。

    Silencer Express Kits提供了20次实验所需试剂，包括带启动子的DNA模版，两端的PCR引物和用于纯化PCR产物的试剂。PCR引物是对SECs的5’和3’端的，末端经特别修饰以提高SEC在哺乳动物细胞中的稳定性。另外试剂盒提供GAPDH正对照的SECs引物以及一个siRNA的负对照。

SECs克隆到载体中便于长期研究
    SECs的优点是快速简单，适合快速筛选，但是作为长期研究最适合的还是以载体形式保存和扩增siRNA。由于SECs的两端引物带有酶切位点，当找到最适合的siRNA后，可以直接克隆在任何载体中，或者，奢侈一点，克隆到已经线性化的带抗生素标记的哺乳动物载体pSECs中就可以了。

注意：

1. 制备流程的第一步可以设计一段包含终止序列（22nt）——反向siRNA模版——环状结构（9nt）——正向siRNA模版——启动子3’端序列（20nt），这样只要和含有PolIII启动子的模版PCR一次就可以得到完整的SECs模版——如果嫌合成90多碱基的寡核苷酸序列太贵太难（合成这么长的DNA可得找一家质量可靠的合成厂家），可以分成两段PCR来合成模版，如图中所示。

2. PCR不要用有校读功能的高保真Taq，比如Pfu，Vent，Tth等，有可能得不到结果。

3. 全长的SECs扩增，其引物是经过修饰的，能够延长PCR产物片断在细胞中的稳定性

4. 据统计随机设计的siRNA通常一半以上都有一定的抑制基因表达的功能，抑制效率平均在50%左右，大约有25%的siRNA可以有高达75%—95%的抑制效率。多设计几个会有好的结果。

5. 设计的siRNA中间不要有连续4个以上的T或者A，否则会被PolIII当作转录终止信号。

6. siRNA的第一个碱基最好是G或者A，这样PolIII启动子能更有效地起始转录，如果3’引物的siRNA第一个碱基不是C或T，可以考虑在其前面加C（正链就是G）。尽管这个添加多余的碱基和模版不配对，不过目前的统计结果表明似乎对结果不影响。如果靶序列和其他部分有12—17个重复序列，最好放弃并重新选择靶序列。

7. 其实整个SECs只有100多碱基，只要克隆进载体并测序后就可以自己设计引物和模版了。

参考资料

1.RNAi——回顾

2.RNAi研究相关的产品介绍之一

3.利用试剂盒，自己制备siRNAs或者dsRNA

4.在细胞内表达siRNA引发基因沉默

5.RNAi技术专刊之五：体外转录合成双链RNA

6.长效抑制基因表达：GeneEraser shRNA表达载体

7.RNAi：制备siRNAs的5种方法——如何选择最适合你的方法

8.RNAi转染试剂龙虎榜——为你的RNAi实验选择合适的转染试剂