刘健华教授：首次揭示质粒编码的可介导替加环素耐药的新型多重耐药外排泵

近期，华南农业大学国家兽医微生物耐药性风险评估实验室在微生物学国际主流学术期刊mBio在线发表了关于肺炎克雷伯菌质粒上发现的一种新型可介导替加环素等药物耐药的多重耐药外排泵基因簇（tmexCD1-toprJ1）的研究论文，该研究系统性地阐述了tmexCD1-toprJ1耐药基因簇的功能、起源以及流行情况。

近年来，质粒等可移动元件介导的耐药基因水平传播所致革兰阴性菌耐药性的快速发展，引起全球高度关注。黏菌素和替加环素是治疗多重耐药革兰氏阴性杆菌感染的少数有效药物，然而，质粒介导黏菌素耐药基因mcr-1的出现及其在全球的广泛传播，导致黏菌素的临床应用价值面临挑战，使替加环素成为治疗多重耐药肠杆菌所致严重感染的有限药物之一。目前，除了染色体上RND型外排泵过表达以及质粒编码的Tet(A)外排泵变异体和替加环素修饰酶Tet(X3)、Tet(X4)和Tet(X5)介导的替加环素耐药机制外，尚未发现可水平转移的RND型外排泵与替加环素耐药性相关的报道。

2017年，课题组分离到鸡源泛耐药肺炎克雷伯菌，同时对替加环素耐药，通过全基因组测序，发现细菌同时携带碳青霉烯耐药基因（blaNDM-1）、黏菌素耐药基因（mcr-1、mcr-8）等30个耐药基因，未检测到已知的替加环素耐药机制，但发现携带一个质粒编码的RND型外排泵基因簇，该基因簇与铜绿假单胞菌染色体上的mexCD-oprJ基因簇有78%的核苷酸序列同源性，同时位于质粒上具有可转移能力，将其命名为tmexCD1-toprJ1（t表示transferable），并推测该基因簇可能与替加环素耐药有关。通过克隆和接合实验，确证tmexCD1-toprJ1可介导肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门氏菌对甘氨酰环素类（替加环素）、四环素类、喹诺酮类、头孢菌素类和氨基糖苷类等多种药物耐药（MIC值增加4～32倍），这意味着tmexCD1-toprJ1也是一种新的质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR）。

为了证实TMexCD1-TOprJ1的外排泵功能，课题组进一步通过细菌药物蓄积实验，发现携带有外排泵的宿主菌的药物蓄积浓度明显低于对照菌株，并对外排泵抑制剂N-甲基吡咯烷酮（NMP）表现出更为显著的反应。此外，小鼠感染模型的替加环素治疗实验结果显示，接种tmexCD1-toprJ1阳性肺炎克雷伯菌的小鼠死亡率更高，提示其可能会导致临床治疗失败。

图1TMexCD1-TOprJ1对替加环素体内体外活性研究

本研究进一步分析了tmexCD1-toprJ1的基因环境和质粒结构，发现tmexCD1-toprJ1位于可接合的IncFIA型质粒（pHNAH8I-1）上，同时该质粒上还携带黏菌素耐药基因（mcr-8）。之后通过分析这种新型外排泵基因簇的基因环境，发现在外排泵上游存在位点特异性整合酶基因，与tnfxB1-tmexC1-tmexD1-toprJ1基因簇一同插入在转座子Tn5393的转座酶tnpA基因中。在Genbank数据库中搜索相应高相似度的序列进行比对分析后，推测外排泵基因簇可能通过假定整合酶，从染色体捕获上并转移到质粒上传播。之后，课题组通过构建遗传进化树方法，发现假单胞菌染色体上存在同源性最为接近的外排泵基因簇，因此推定tmexCD1-toprJ1可能来源于某种假单胞菌染色体。

图2 pHNAH8I-1质粒结构和tmexCD1-toprJ1基因环境比较图

图3 TMexD1及相关高同源性蛋白遗传进化树

课题组随后进行流行病学调查，发现tmexCD1-toprJ1主要在国内多个地区养鸡场中广泛传播，并已扩散至动物性食品和人，主要在肺炎克雷伯菌及其相近菌属中流行。尽管tmexCD1-toprJ1在人源肠杆菌中检出率较低，但考虑到tmexCD1-toprJ1的可转移性和外排泵底物的广泛性，tmexCD1-toprJ1可能会进一步传播，对食品安全和人类健康构成潜在威胁。

图4携带tmexCD1-toprJ1阳性菌株流行分布情况

本研究首次报道了一种新型的质粒介导的多重耐药RND家族外排泵，此外排泵可导致包括替加环素在内的多种临床常用药物耐药。因此，应加强相应的流行病学监测，以控制携带TMexCD1-TOprJ1外排泵菌株的进一步传播。

刘健华，女，1973年10月出生于江西省宜春市，农学博士，教授，博士生导师。

国家杰出青年基金获得者，广东省特支计划“百千万工程领军人才”，广东省“千百十工程”省级培养对象，全国兽药残留与耐药性控制专家委员会委员，国家兽医微生物耐药性风险评估实验室副主任。

2001年在中国农业大学获得临床兽医学博士学位，此后在华南农业大学从事博士后研究，2003年7月出站后留校任教并受聘副教授，2013年晋升为教授。

长期从事细菌耐药性和兽药安全评价研究，在动物源肠杆菌对多粘菌素类、磷霉素类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类和氨基糖苷类药物等的耐药性产生和传播机制方面开展了系列研究工作，在国际上首次发现了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1。相关研究成果以第一作者或通讯作者发表SCI收录论文39篇，影响因子累计超过200，累计被引用1800多次，单篇最高他引600多次，H指数21，其中有两篇论文入选为ESI高被引论文，两篇被F1000Prime 推荐和点评。

曾获教育部高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）科技进步一等奖1项和广东省科技进步二等奖1项，并获得首届盛彤笙兽医科学奖--杰出青年学者奖。

先后指导和协助指导多名研究生进行耐药性方面的研究，其中有3人获广东省优秀硕士论文奖、14人获校优秀硕士论文奖、1人获校优秀博士论文奖、1人获得广东省“南粤优秀研究生”称号和2人获“广东省优秀研究生”称号。协助指导的1名博士研究生获全国百篇优秀博士论文提名奖、1人获广东省优秀博士论文奖。