定量PCR，从理论到实践，从入门到精通（一）
——基础概念篇
Real Time PCR，即实时荧光定量PCR，也被称为定量PCR或qPCR，是实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。
由于定量PCR具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，被广泛应用于医学检测、药物疗效考核、基因表达研究、转基因研究、基因检测、病原体检测、动植物检测、食品检测等各种领域。
所以，无论您从事生命科学的基础研究，还是制药企业、畜牧养殖企业、食品企业的从业人员，乃至出入境检验检疫局、环境监测部门、医院等单位的员工，都会或多或少地接触到或者需要了解掌握定量PCR的知识。 |
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Real Time PCR的原理
Real Time PCR，是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过定量PCR仪器，对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。
【扩增曲线】即描述PCR动态进程的曲线。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是S形曲线（见下图）。
【扩增曲线的平台期】随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭、反应副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，致使PCR并非一直呈指数扩增，而最终将进入平台期。
由于影响PCR扩增的因素错综复杂，因此每次PCR扩增时进入平台期的时机及信号高低变化很大，很难准确控制。
【扩增曲线的指数增长区】下图是同一样品重复进行96次Real Time PCR扩增时的实时监测结果，从这张图上我们可以看出，尽管平台期的变化很大，但在扩增曲线的指数增长区的某一区域，重复性非常好，这对PCR的定量分析非常重要。
【阈值和Ct值】我们在扩增曲线的指数增长区适当位置设定荧光检出界限值，即阈值（Threshold）。阈值与扩增曲线的交点就是Ct值，也就是Ct值是指达到阈值时的循环圈数（Threshold Cycle）。
下图清晰地显示了阈值线与扩增曲线、阈值与Ct值之间的关系。
【如何定量？】
经数学理论证明，Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。Real Time PCR实时监控PCR扩增产物，在指数扩增期进行定量。
PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期。
假设起始DNA的量为A0，经过了n个循环后，理论上DNA产物的量可以表示为：
An=A0×2n
那么，起始DNA量A0越多，扩增产物的量便越早达到检出值An，达到An时的循环圈数即Ct值。也就是起始DNA量A0越多，扩增曲线越早起峰，对应需要的循环圈数n越小。
我们将已知浓度的标准品进行梯度稀释，作为模板进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。根据Ct值与起始模板数的对数值之间的线性关系，就可以制作出【标准曲线】。
未知浓度的样品的Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是Real Time PCR的定量原理。
Real Time PCR的检测方法
Real Time PCR是通过检测反应体系中的荧光强度来检测PCR扩增产物的，其荧光检出方法可分为荧光染料嵌合法和荧光探针法两大种类。
【荧光染料嵌合法的原理】
荧光染料，如TB Green®，可以与PCR体系中的双链DNA非特异性结合，结合后会发出荧光。
随着PCR循环圈数的增加，反应体系中的荧光强度呈指数增加。通过检测荧光强度，可以实时监测反应体系中的DNA扩增量，进而反推算样本中的起始模板量。
【荧光探针法的原理】
荧光探针是5'端带有荧光基团，3'端带有淬灭基团的一段核酸序列，可以与模板特异性结合。当探针完整时，荧光基团发射的荧光被淬灭基团淬灭，不能发出荧光。而当探针被分解后，荧光物质会游离出来，发出荧光。
PCR反应液中加入了荧光探针，在退火过程中，荧光探针便会和模板的特异位置结合。延伸过程中，PCR酶的5'→3'外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，荧光物质游离处理，发出荧光。通过检测反应体系中探针的荧光强度，可以达到监测PCR产物扩增量的目的。
【荧光检测方法的选择】
如果用于区别同源性高的序列，以及进行SNP分型解析等多重PCR检测，荧光探针法无可替代。
而进行除此之外的Real Time PCR实验，我们推荐使用简单易行、成本低的荧光嵌合法。
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染料法 |
探针法 |
| 优点 |
简单易行，成本较低，无需合成特异性探针 |
特异性强，能进行多重PCR。 |
| 缺点 |
对扩增的特异性要求高；不能进行多重PCR |
需要设计特异性探针，成本较高；有时探针设计困难。 |
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