随着测序技术尤其是高通量测序技术的迅速发展，人们对基因表达与表型之间关系的认识越来越深刻。在基因表达层面上，不同的细胞具有独特的转录组，即便是那些看似相同的细胞群，细胞之间 的RNA 水平上却差异巨大，然而由于受到检测的敏感度等技术限制，绝大部分转录组的研究还只能在几十万或上百万个细胞水平上才能开展。计算出的基因表达水平只是一群细胞的平均值，细胞特异性表达的基因或是某些转录本的剪接体无法被发现。

       单细胞转录组测序技术是在单细胞水平对转录组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞中微量的转录组RNA通过高效扩增后再进行高通量测序。2011年，《Nature Methods》将单细胞测序列为当年度值得期待的技术之一；2013年1月，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首；2014年1月，《Nature Methods》将单细胞测序列为 2013 年度最重要的方法学进展，并且指出刊登在《Nature》系列杂志上的单细胞测序文章在2013年出现了大爆发。单细胞转录组测序能够有效解决微量样本（如胚胎细胞、干细胞等）无法进行常规高通量测序，以及组织样本无法破解的细胞异质性（如神经细胞、肿瘤细胞）难题。

技术路线

数据分析流程

经典应用案例

       单细胞转录组测序能够在单细胞层面上、在全基因组范围内，研究基因调控网络与表型的关系，目前主要应用于以下几个领域：

（1）神经生物学 

       神经组织是一类高度复杂的组织，神经元表达的基因多于其它类型的细胞，导致了神经元具有很高的异质性。以大脑为例，它是机体最复杂的器官，包含有许多种类的细胞，它们的基因表达模式存在很大的差异，单细胞测序技术将有助于我们确定神经元、胶质细胞和血管细胞的特定标志物，并将其与其他信息相关联，从而阐明人类大脑的细胞复杂性。单细胞转录组分析甚至还可以应用于不同亚细胞结构的基因表达谱分析。众所周知在神经元中mRNAs需从细胞体活性转运至轴突或树突进行翻译。单细胞转录组分析可用于检测在轴突或树突特异性定位的mRNAs，从而用于确定这些神经元的生理功能。

案例：Li CL, Li KC, Wu D, Chen Y, Luo H, Zhao JR, Wang SS, Sun MM, Lu YJ, Zhong YQ, Hu XY, Hou R, Zhou BB, Bao L, Xiao HS, Zhang X. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Res 2015, 26(1):83-102.

       伯豪生物助力中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所张旭研究组，通过高覆盖度的单细胞测序和以神经元大小为参考的层次聚类，对小鼠背根神经节初级感觉神经元进行了分类，又通过全细胞膜片钳在体记录结合单细胞PCR方法可检测各类初级感觉神经元对外周皮肤刺激的反应。该工作首次通过高覆盖的单细胞测序对初级感觉神经元进行了重新分类，并且建立了基因表达与在体功能的相互关系。 

（2）肿瘤异质性和耐药 

       肿瘤是疾病状态下的、具有高度异质性的组织，肿瘤基因组的存在高度多样性及动态变化。单细胞转录组测序将帮助我们对隐藏于的罕见细胞类型及突变进行检测，它们可能会最终导致耐药的发生，从而从根本上避免给患者服用无效、甚至有毒性的药物进行治疗。肿瘤细胞基因组的这种高度多态性，是癌症的一大特征，也是有待我们开发利用的潜在治疗靶点。

       案例：Kim KT, Lee HW, Lee HO, Kim SC, Seo YJ, et al. Single-cell mRNA sequencing identifies subclonal heterogeneity in anti-cancer drug responses of lung adenocarcinoma cells. Genome Biol 2015, 16:127.

（3）循环肿瘤细胞 

       肿瘤细胞的另一个特性是具有转移能力，癌细胞从原发肿瘤脱落，进入血液或淋巴循环系统，其中一些具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来，成为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell， CTC），并进一步发展为远端器官转移肿瘤。CTC在病人外周血中存在的数量极其稀少，利用单细胞测序技术对CTC进行组学分析将有助于我们更好地了解肿瘤转移的生物学机制；同时，作为一种非侵袭性的检测手段，CTC的测序数据还可以为疗效评价、预后判断以及个体化治疗提供及时可靠的依据。

       案例：Miyamoto DT, Zheng Y, Wittner BS, Lee RJ, Zhu H, et al. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance. Science 2015, 349(6254):1351-1356.

       Androgen deprivation therapy，也就是雄激素剥夺疗法（ADT，也称为去势治疗）主要是通过注射抑制睾酮产生的药物来治疗癌症。ADT已经成为仅次于手术治疗的第2种最常见的局灶性前列腺癌的治疗手段。研究人员从13位接受治疗的患者体内收集了77份循环肿瘤细胞（CTC），并完成了总RNA序列分析。通过比对未进行治疗患者样品，研究人员发现了AR抗性组出现了Wnt信号通路被激活的现象。研究人员在单个实验中还发现提高Wnt信号，即使是存在强劲雄激素抑制剂的时候，也会增强前列腺癌细胞的存活能力，而抑制这一信号途径，则会减少细胞的增殖。 

（4）早期胚胎发育和干细胞研究 

       在某些情况下，由于无法收集大量的细胞，例如人类早期胚胎中的细胞数目非常少而且很难获得，单细胞技术使这些样本的转录组分析成为可能，同时更有助于深入理解细胞分化、重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。

       案例：Xue Z, Huang K, Cai C, Cai L, Jiang CY, et al. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing. Nature 2013, 500(7464):593-597.

       本研究采用单细胞RNA-seq技术对人类和小鼠胚胎从卵母细胞到桑椹胚阶段的转录组动态进行了全面的分析。通过权重基因共表达网络分析（WGCNA），发现通过少量共表达基因功能性模块就可以简明地描绘每个发育阶段。小鼠和人类植入前胚胎比较分析结果表明，人类和小鼠之间发育特异性和时序上存在差异，大多数的人类阶段特异性模块（9个中有7个）在物种间具有保守性。此外，鉴别出人类和小鼠网络中一些保守的模块成员：hub 基因。这些新型的候选基因可能参与调控哺乳动物着床期以前的胚胎发育过程。