优势
Arraystar m6A 单碱基分辨率芯片相比于传统m6A-seq具有优势：
- 利用不依赖m6A抗体富集的方法系统性分析RNA m6A修饰谱
- 单碱基分辨率精确检测m6ACA修饰位点
- 定量分析m6A修饰的百分比和丰度
- 样本要求量低，可低至1 ug总RNA
- 多个专业数据库收集并注释可量化的单个、多聚和成簇的m6ACA位点
简介
在单碱基水平上定量m6A修饰仍然具有极大的挑战性。传统的m6A/MeRIP-seq这两种方法使得研究m6A表观转录组学成为可能[1-5]，却不能精确鉴定出MeRIP-seq的peak区域内具体是哪一个腺嘌呤（A）发生了m6A修饰，也不能定量分析每个位点的修饰百分比[6]。
为了解决这一难题，Arraystar公司研发了m6A单碱基分辨率芯片，可以将m6A修饰精确定位到具体的腺嘌呤（A）上，并且能定量分析m6A修饰位点的百分比及差异变化。
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Arraystar m6A 单碱基分辨率芯片 |
MeRIP-Seq |
定量 |
m6A修饰百分比
m6A修饰的RNA丰度
m6A修饰的RNA百分比及丰度的差异变化 |
无m6A修饰百分比
只能提供m6A修饰的RNA丰度变化 |
m6A位点分辨率 |
单碱基水平 |
~ 100 nt |
样本起始量 |
≥1μg总RNA |
≥120μg总RNA |
Poly(A)富集/rRNA去除 |
不需要 |
需要(甚至需要放大) |
RNA完整性要求 |
要求低 |
要求高 |
不依赖抗体的m6A修饰检测方法
由于m6A抗体会与其他修饰（比如m6Am）产生交叉反应[1, 7-9]，所以基于m6A抗体的检测方法其特异性存在限制。并且，在缺乏正交实验作为独立参照的情况下，m6A抗体检测出的m6A修饰谱无法系统性评估检测结果的准确度。与依赖于m6A抗体免疫富集的MeRIP和miCLIP方法不同，Arraystar提出，基于甲基化敏感的RNA内切酶MazF的酶切原理设计出的芯片，可以系统性检测m6A修饰谱。
单碱基分辨率定位m6A修饰位点
RNA内切酶MazF识别RNA单链并在非甲基化的ACA位点的5’端进行切割，而不能切割甲基化的m6ACA位点(图1) [1, 10]。将抽提的总RNA样本分为两份，一份不加MazF处理，标记上Cy3荧光，另一份加MazF处理后，标记上Cy5的荧光。标记好后的RNA样本合并在一起与Arraystar m6A单碱基分辨率芯片杂交，从而定量分析每个位点的m6A修饰百分比和丰度(图2)。
图 1. MazF可以在非甲基化ACA位点切割，而无法在甲基化m6ACA位点发挥作用
m6A修饰百分比
m6A修饰百分比（在某个位点处发生m6A修饰的RNA与未发生m6A修饰的RNA之间的比值）的检测，对于阐明m6A修饰的重要功能、回答关于m6A甲基化的添加/识别/去除、m6A的调控机制、应激过程的m6A修饰动态变化及m6A修饰位点研究的重要性等问题都是至关重要的[3, 11, 12]。m6A修饰的百分比可以通过每个位点的双荧光通道信号值进行定量，解决了长期以来无法检测m6A修饰百分比动态变化的困扰。
低样本量要求
Arraystar m6A单碱基分辨率芯片只需要低至1μg的总RNA。MazF的酶促反应即使在ng或pg级别的极低RNA量的情况下，仍然可以保持极高的敏感性和特异性。因此，稀有样本，尤其是病理切片、活检样本、少量分选细胞、小型动物模型，都可以用m6A单碱基分辨率芯片进行m6A修饰的高通量筛选。
图 2. Arraystar m6A单碱基分辨率芯片实验流程
可靠的指标收集和全面的注释信息
大部分m6A修饰发生在含有核心ACA序列的保守motif区域，通常称为是m6ACA位点。为了收集可靠的m6ACA位点，Arraystar m6A单碱基分辨率芯片设计了系统性的检测方法，通过探针对所有的m6ACA位点进行定量分析，最终得到可靠性高的ACA位点。在一个ACA位点的40nt范围内不存在其他ACA位点就可以被一个探针特异性检测，这个位点被定义为可定量的单一ACA位点。用一个探针检测到的聚集在20nt范围内的串联ACA位点，定义为可定量的多聚ACA位点。另外，当多个单一ACA位点或多聚ACA位点分布在500nt范围内，并且两者之间的距离＜100nt，他们就会聚集成一个成簇ACA 位点(图3)，这种位点可以通过探针检测单一ACA位点和多聚ACA位点进行分析。在RNA中，不是所有的ACA序列都有m6A修饰。Arraystar m6A单碱基分辨率芯片中收录的高可信度与极高可信度的单一、多聚及成簇的可定量的ACA位点均可在miCLIP数据集中查找到对应m6A修饰位点[13-16]，或修饰位点接近于m6A-seq的峰值处[17]。
图 3. 芯片可定量的单一、多聚、成簇m6ACA位点的收集方式。
单一、多聚、成簇m6A修饰位点的重要功能
单一m6A修饰位点通常与mRNA翻译起始和翻译延伸的动态调控相关，也可以调控非编码RNA的降解和活性。
5’UTR区的单一m6A修饰位点促进HSP70 mRNA非帽子依赖的翻译起始
Hsp70 mRNA的5’UTR区只要有一个碱基发生m6A修饰便足以启动非经典的非帽子依赖的翻译途径(图4) [18]。在压力条件下，定位在核里的识别蛋白YTHDF2阻止FTO对m6A修饰位点的去甲基化过程。翻译起始因子eIF3可以直接结合在m6A位点，促进HSP70 mRNA的翻译过程。因此，压力应激下，细胞会终止大量的其他mRNA的翻译过程，但Hsp70 mRNA仍然可以起始非帽子依赖的翻译途径。
图 4. 热休克压力下，HSP70 mRNA通过单个m6A修饰位点起始非帽子依赖的翻译途径的分子机制[18, 19]。
CDS区的单个m6A修饰位点调控mRNA翻译的动态变化
在mRNA编码序列区（CDS）发生的单个m6A修饰可以调控翻译延伸的动态变化[20]。一个密码子上发生m6A修饰将下调同工tRNA的解码效率，也可以作为tRNA结合mRNA与翻译延伸的阻碍物。m6A阻止翻译进行，可能会产生截短的蛋白链，进而影响正在翻译的蛋白的折叠、与分子伴侣的互作、定位信号的识别，这些都是导致蛋白命运改变与活性改变的潜在因素[21]。可以想象，如果m6A修饰使得一个密码子错译成其他的氨基酸，即便m6A修饰丰度很低，也将引起蛋白功能缺失的变异，进而引起一系列生物学效应[20](图. 5)。
图. 5. 翻译延伸的动态学调控可以影响共同翻译的初生蛋白的折叠，以及与其他伴侣分子的互作[20]。
单一m6A修饰位点调控lncRNA功能缺失
linc1281的单一m6A修饰位点(A917, A1025和A1056)足以调控linc1281吸附let-7的能力(图6) [22]。linc1281的m6A修饰通过阻断这些干细胞多能性相关的miRNA的功能，确保小鼠胚胎干细胞的特性。
图6. linc1281最后一个外显子上的单一m6A修饰位点，调控linc1281结合let-7，发挥ceRNA机制，促进mSEC分化的功能[22]。
多聚与成簇m6A位点参与mRNA相分离
多个m6A位点聚集成簇，对于细胞质中mRNA的降解，调控mRNA半衰期具有重要作用。m6A识别蛋白通过靶向mRNA上的m6A修饰位点进入细胞质组分促进细胞相分离调控mRNA代谢命运。高度m6A修饰的多聚甲基化区域对lncRNA功能激活也是必不可少的
多聚和成簇（而非单一）的m6A修饰位点，通过调控相分离的方式，将mRNA划分至不同的亚细胞组分(图7) [23]。胞外可自发进入相分离。多聚甲基化修饰的mRNA为YTHDF的结合提供多个位点，促使YTHDF将mRNA带入不同的分离相的细胞组分中，比如P小体、应激颗粒、神经细胞RNA颗粒，从而介导RNA的不同代谢命运。例如，多聚甲基化的mRNA滞留在应激颗粒中可以抑制mRNA的翻译、YTHDF2识别多聚甲基化mRNA进入P小体可以促进mRNA的降解[24]。然而，单一的m6A甲基化位点在此过程中不足以提供YTHDF结合的亲和力[23]。
图7. 多聚m6A甲基化位点结合胞质中的YTHDF1/2/3识别蛋白时具有多重的亲和力，并被分离至亚细胞组分调控RNA代谢命运。
m6A 表观转录组学研究路线图
Arraystar m6A 单碱基分辨率芯片详情
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Human |
Mouse> |
Rat |
| 芯片规格 |
8 x 15K |
8 x 15K |
8 x 15K |
| 探针总数 |
14,321 |
14,319 |
14,581 |
| 探针长度 |
60nt
|
| m6ACA位点来源 |
miCLIP dataset[13-16]; m6A-seq peak summits[17] |
| 单一m6ACA 位点 |
11,237 |
11,120 |
11,499 |
| 多聚m6ACA 位点 |
3,084 |
3,199 |
3,082 |
| 成簇m6ACA 位点 |
693 |
279 |
2,614 |
References
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