『石以砥焉，化钝为利！』Takara匠心打磨FFPE样本分析利器

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工欲善其事必先利其器，分析FFPE样本必须选对技术与试剂。本专题将向您介绍Takara科学家匠心打磨出的FFPE样本分析利器，帮您填平FFPE样本核酸扩增难、定量难、NGS建库难、结果一致性不足这几个大坑，使分析FFPE样本变得都挺好。

福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded, FFPE）技术是一种先用福尔马林固定，再用石蜡包埋临床组织样本的处理方法。由其可长期常温保存的特点被全球的医院或组织样本库大量采用，供组织学诊断及研究使用。

随着qPCR、NGS等技术发展，数亿份FFPE样本有了更大的研究价值。这些珍贵并来源广泛的医学研究材料为回顾性研究、阐明疾病发病机理、Biomarker筛查、预后指示等提供了宝贵的资源。

然而，福尔马林固定样本时，组织中的核酸容易发生不同程度的降解与分子间交联，石蜡的高温渗入又进一步加速核酸的降解，保存时间及环境对核酸也有不小影响，即FFPE样本中不易留存高品质核酸。同时，提取核酸前不当的前处理方案，不合适的扩增方法与条件也不易获得足够量的核酸。再者，若一次性分析的样本量较大，实验员的样本处理、仪器和方法之间的微小差异会引起结果发生显著变化，导致核酸质量、下游实验结果的可靠性、重复性与一致性存疑。

以上因素，让科研工作者既要面对挑战与困难，又不忍舍弃FFPE样本这一“宝藏”，to do or not to do, that’s a question?

有了Takara FFPE样本分析利器，事情正在发生变化！

突破瓶颈，DV₂₀₀≥25%的FFPE样本进行RNA-Seq研究成为可能！

从FFPE样本中分离纯化核酸进行NGS分析研究逐渐成为重要手段，但由于FFPE样本容易发生核酸的降解和损伤，所以从有限且珍贵的FFPE样本中获得完整且准确的信息进行建库测序无疑是“难于上青天”！Takara倾力打造的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian，具有难以置信的RNA品质包容度，可以5-50 ng FFPE来源的total RNA起始，即使是品质较差的样本，也可以构建高品质的文库！同时采用全新的Zap R v2 R-Probes v2核糖体cDNA去除技术，不需要进行rRNA去除的前处理操作，不要太好用！
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一个神奇的FFPE样本建库神器之RNA篇

讲座视频

一种针对困难样本（如FFPE样本）制备RNA-Seq文库的新方法。

在本次讲座中，Dr. Nathalie Bolduc (Takara Bio USA, Inc.) 主要介绍了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian，该试剂盒可以从250 pg-10 ng不同品质的哺乳动物Total RNA,（包括FFPE样本）中生成高质量的测序文库。

快人一步，仅需2h即可完成FFPE样本的DNA-Seq文库构建！

FFPE样本，作为生物和医学领域的重要样本来源，广受研究者的青睐。但由于多种因素影响，一般从FFPE样本中难以获得高质量且足量的DNA。因此在构建文库时，文库的转化效率差，文库片段较小，测序重复序列较多，覆盖度较低等一系列问题颇受诟病！SMARTer ThruPLEX DNA-Seq Kit 使用特别的茎环型接头，整个建库过程无需转管和纯化，可以100 ng FFPE来源的DNA起始2小时内完成构建文库，从而实现对FFPE样本进行有效分析！

针对9种不同的100 ng 的FFPE样本,分别使用SMARTer ThruPLEX DNA-Seq Kit 、A公司试剂盒和B公司试剂盒制备文库。与其它公司同类试剂盒相比，使用本试剂盒可以获得更高的文库多样性和更低的重复read比例，且构建文库产生的片段较长。另外在不同GC含量范围内可以产生更均匀的覆盖分布。

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当ThruPLEX技术遇上FFPE样本，会带来怎样的“神仙操作”！

应用文献
1. B. Lawrence ., Recurrent loss of heterozygosity correlates with clinical outcome in pancreatic neuroendocrine cancer. npj Genomic Medicine (2018)
本研究实验以3-50 ng的FFPE-DNA样本起始，使用ThruPLEX-FD Kit（现为ThruPLEX DNA-Seq Kit）制备全基因组测序文库，分析胰腺神经内分泌瘤的拷贝数变异情况。

2. S-F Chin et al., Shallow whole genome sequencing for robust copy number profiling of formalin- fixed paraffin-embedded breast cancers. bioRxiv Prepr. (2017).
本研究使用4-500 ng的乳腺癌FFPE-DNA样本，进行低深度全基因组测序(sWGS)分析。其中，NGS文库由ThruPLEX DNA-Seq Kit和A公司试剂盒制备。

3. P. Cejas et al., Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumorspecific enhancer profiles. Nat. Med. 22, 685–691 (2016).
本研究开发了一种使用FFPE组织进行ChIP实验进而准确检测组蛋白标记的新技术-FiT-seq。其中文库由ThruPLEX-FD Prep Kit（现为ThruPLEX DNA-seq Kit）制备。

FFPE样本难扩增？改良的MightyAmp™ Ver.3发挥威力！

数量巨大的FFPE样本蕴含着无限的科学研究机会，但同时也是研究者们很棘手的研究对象，如何从样本中获得生物信息就显得至关重要。PCR技术作为分子检测领域中较为普遍的技术，大大提高了FFPE组织样本的临床应用。

Takara作为PCR酶的重要企业，自1994年开始销售PCR酶以来，为了满足科研人员的各种要求，一直致力于新产品的开发。特别研发的MightyAmp™系列具有很强的扩增性能，对于使用普通PCR酶难以扩增的样本，也显示出很好的扩增能力，如含有大量PCR阻害物的生体粗提样本。

MightyAmp DNA Polymerase Ver.3是对MightyAmp DNA Polymerase进行了改良，这种改良后的PCR酶和Buffer组合使用，可进一步增强对PCR阻害物的抵抗性。此外，也提高了血液、动植物组织等生物体样本直接加入到反应液中的Direct PCR的反应性能。无论是PCR阻害物含量较多的粗提样本，还是GC Rich、AT Rich的模板均可在宽广的模板范围内进行有效扩增，并根据需要将试剂盒中附带的10×Additive for High Specificity添加到PCR反应液中可提高PCR扩增的特异性和检测灵敏度。

操作流程：

更多详情：
MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3

关联资料

一步法cDNA合成反应，操作简单。Takara RT-qPCR方案高灵敏度定量FFPE来源miRNA!

癌症已经成为人类的“杀手”，较难医治。国际抗癌联盟认为，1/3的癌症是可以预防的，1/3的癌症如能早期诊断是可以治愈的，1/3的癌症可以减轻痛苦，延长生命。FFPE样本作为生物和医学领域的重要样本来源，已经成为许多研究人员重要的癌症研究材料。

当前，研究人员更迫切需要一种快速有效的癌症研究方法。RT-qPCR就是一种可以快速，灵敏地定量基因表达的技术，能从相对少量的起始材料（如FFPE样本）中检测mRNA，miRNA，lncRNA的差异表达。该技术应用广泛，检测灵敏度高，检测低拷贝RNA非常实用。

这其中需要特别说明microRNA的定量研究。microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。长度为22 nt左右，与普通的捕获探针或PCR引物的长度相当，并且GC% 含量从5%-95%，差异较大，普通检测方法很难获得足够的灵敏度，所以需要针对microRNA优化qPCR体系。

Takara提供用于microRNA定量检测的Mir-X™ 系列产品。Mir-X™ 系列为简单的一步法cDNA合成系统、一次反转FFPE样本中的不同microRNA。试剂盒附带通用的PCR下游引物，只需设计特异性的上游引物即可。可对低至50 copies的microRNA进行检测，灵敏度高。高度特异性检测不同的miRNA变种。

更多详情：
Mir-X™ miRNA qRT-PCR TB Green™ Kit

应用文献

1. Makino, K. et al. Inhibition of uterine sarcoma cell growth through suppression of endogenous tyrosine kinase B signaling. PLoS One 7 , e41049 (2012)
本研究用RR037A PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)分析冷冻和FFPE子宫平滑肌肉瘤标本的基因表达水平。这些发现涉及到TrkB信号传导，并为癌症治疗提供了潜在的药物靶点。

2. Jiang, Y. et al. Aberrant expression of RSK4 in breast cancer and its role in the regulation of tumorigenicity. Int. J. Mol. Med. 40, 883–890 (2017).
本研究使用RR390A Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)，准确且特异性地对来自8位乳腺癌患者的细胞系和4种组织样本（正常和癌症）中RSK4的表达进行检测。

3. Taek Sang Lee et al. Aberrant MicroRNA Expression in Endometrial Carcinoma Using Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) Tissues. PLoS One. 2013; 8(12): e81421.
研究人员在子宫内膜样腺癌（EEC）和正常子宫内膜中用人microarray鉴定了microRNA表达的差异。另外，使用638314 Mir-X™ miRNA qRT-PCR TB Green™ Kit对30个FFPE标本（20个EEC，10个正常子宫内膜）进行了qRT-PCR-mir表达分析，并再次确认了癌症和正常组织之间差异表达的结果。

一次最多运行5184个qPCR反应的Real-Time PCR系统，高通量检测FFPE来源miRNA！

数以亿份的FFPE样本保存着巨大的科学研究价值。除核酸提取、建库等难题外，如何高效、快速、准确地完成大量样本的分析检测工作，也同样是需要面对的挑战。

SmartChip Real-Time PCR System是高通量qPCR系统。一次运行可同时进行最多5,184个qPCR反应。灵活的Assay × Sample组合，可添加或删除各个PCR反应。2小时即可完成qPCR反应和数据分析。100 nL反应体系，既保证检测的灵敏度，又节约了试剂成本。

讲座视频
灵活、高通量的SmartChip qPCR系统助力您的Gene Expression和Genotyping分析！

Chris Sontag博士将在webinar中为大家详细介绍SmartChip Real-Time PCR System。SmartChip系统可以进行高通量的real-time PCR，用于基因表达分析和SNP基因分型研究。通过Chris Sontag博士的讲解，大家会进一步了解SmartChip系统的性能，以及它在多种研究领域中的良好表现，包括抗生素抗性基因研究、癌症相关的miRNAs研究、人血液样本和动物样本的基因分型研究等。欢迎大家的参与！

SmartChip Real-Time PCR系统凭借高通量、灵活性强的特性帮助许多研究人员对各类型样本中的核酸进行检测分析。

来自卢森堡联合生物样本库（Integrated Biobank of Luxembourg, IBBL）的研究人员，对不同固定处理时间的不同组织FFPE样本中miRNA和snoRNA（small nucleolar RNA，核仁小RNA）进行了分析研究。MicroRNAs（miRNAs）因其结构短小，即使在FFPE样本中依然有很好的稳定性。当前研究表明，miRNAs可以作为生物标志物用于疾病诊断，如癌症相关研究。凭借SmartChip系统高通量、高重复性的表现，配合我们的SmartChip Human miRNA Panel v3.0，研究人员完成了对超过1,000个miRNA和snoRNA的分析工作，并进一步开发出了“snoRNA score”评价系统，一次运行即可对40种样本进行评价检测，该评价系统可以帮助更多研究人员对FFPE样本进行评价分析。

工作流程：

随着科学技术的不断进步，FFPE样本制作保存水平也会不断提高，研究人员可以对FFPE样本中更多类型的核酸进行检测分析。选择SmartChip Real-Time PCR System，快速、灵活、高效完成FFPE样品核酸检测分析，FFPE样品再多也不愁！

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高通量、纳升体系qPCR系统——SmartChip Real-Time PCR System

应用文献

1.Ammerlaan, W. et al. Small Nucleolar RNA Score: An Assay to Detect Formalin-Overfixed Tissue. Biopreserv. Biobank. 16, 467 (2018). 本研究通过高通量SmartChip qPCR技术开发了一种用于评价鉴定FFPE样本过度固定的方法。通过这种方法，研究人员可以在一次运行中检测多达40种样本，而无需担心检测的准确性。

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