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生物通首页 > 今日动态 > 专题总汇 > 全球访谈纪要:PacBio RS第三代单分子测序系统
引言
        第三代单分子测序概念一经提出,就在全球范围内引起了巨大反响,被誉为“未来测序应用的基准线”。
        作为第三代测序技术的代表,也是目前唯一面市的PacBio RS系统,自发售至今走过了最不平凡的25个月。
        期间,几经褒奖,几经质疑。
        有人说,它是“革命性的仪器”,让人类首次领略了单分子合成观测的魅力。
        也有人说,它“门槛太高、应用太窄”,是个奢侈品,无法在常规场合进行推广。
        有人说,它“粗旷而不失细腻”,既能长读长覆盖,又能实时动态记录单碱基信息。
        也有人说,它“眼高手低”,高错误率似乎是个硬伤。
        期间,昔日的同门逐渐淡出江湖。
        Helicos已申请破产保护,Complete Genomics难逃被收购的命运,Oxford Nanopore虽然呼声很高,但宛若空中楼阁迟迟不见现身。唯有PacBio还在奋力前行。
        业界骚动!!不是为了二代测序保住了市场而欢呼,而是为了三代测序的命运坎坷而忧愁,更是为了PacBio的硕果仅存而思考。
        “它到底还能走多远,它到底能走得多好?!”
        问这个问题的人很多,有专家,有媒体,有在用用户,有观望用户,还有大批热衷于新技术的科研粉丝。
        特此收集了PacBio问世以来的一些媒体采访、专家点评、用户心得、官方发言,以主题形式汇编梳理,期望用“原汁原味”的方式,为您呈上2013年的一道“访谈烩菜”。作为谈资也罢,作为解惑也罢,只要您曾经关注过第三代测序,或者正在关注第三代测序。

PacBio公司创始人
Stephen Turner


PacBio公司创始人
Jonas Korlach



      主题一:PacBio单分子实时测序技术存在的价值


Broad研究院把PacBio RS系统作为基因分型验证的首选工具
        我们分别利用PacBio平台和Illumina MiSeq平台进行对比验证,结果发现PacBio数据有着更好的准确性和假阳性检出率,相对而言是一种更为有效的验证工具。
——Mauricio Carneiro(美国Broad研究院医疗和人口遗传学项目组计算生物学家)
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如何正确看待错误率和测序数据质量
        随机错误是相对比较容易用概率算法进行修正的,但修复系统性误差就不是统计学能够解决的范畴了。……我们开发的算法将PacBio错误率从15%减少为不到千分之一。
——Michael Schatz(美国冷泉港实验室沃森生物科学学院定量生物学助理教授)
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拥有高质量参考基因组和缺口修复工作的重要性
        大量的基因组空白区域中可能存在重要的生物学信息,如果无法补齐Gap,不仅不能获得完整的基因图谱,还会给后续的关键信息解读造成很大的困难。
——Richard Gibbs(美国Baylor医学院人类基因组测序中心总监)
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PacBio在揭示德国大肠杆菌疫情爆发菌株中的突出作用
        在此项目证实了PacBio在复杂微生物病原体的de novo测序的能力,以及在多个基因组快速测序上的威力,这些有助于阐明病原体微生物的进化史。
——Eric Schadt(美国西奈山医院基因组学和多尺度生物学研究所总监)
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PacBio RS系统全球用户总评
        为了维持基因组学的前沿地位,我们探索基因组测序中的新机会。我们计划使用PacBio来改善病原体的de novo拼接,并提高一些物种的序列信息覆盖度,在未来,我们将通过甲基化位点的直接检测来探索表观遗传学。
——Harold Swerdlow(英国Sanger研究院研发部总监)
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      主题二: PacBio RS系统在de novo测序中的优势


利用PacBio RS系统独立完成微生物de novo完整测序
        在羊病微生物基因组de novo测序项目中,我们利用PacBio大于6 Kb的读长数据,只用了20X覆盖度就拼出了1个Contig,而且这一个Contig即是一条染色体。

——Timothy Smith(美国农业部肉类动物研究中心分子遗传学专家)
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PacBio系统结合二代测序技术进行高等基因组的混合拼接
        我们研究组先用Illumina数据拼出了Rhodobacter细菌的Scaffold,然后用PacBio的长读长数据去填补Gap。在加入PacBio数据之前,一个Scaffold包含22个Contig,加入PacBio数据后,结果立即改观,拼成了一个巨大的Contig。

——David Jaffe(美国Broad研究院计算研发部总监)
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PacBio系统适用的混合拼接和独立组装软件介绍
        我们专门开发了高度自动化的工具PBJelly,能够将PacBio长片段与基因组草图进行比对,填补或减少草图中的缺口,从而完善基因组草图。

——Adam English(美国Baylor医学院人类基因组测序中心生物信息学家)
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      主题三: PacBio RS系统首次实现对碱基修饰进行直接测序


碱基修饰直接测序法的经典案例
        你可以通过监测DNA合成得到碱基序列信息,同时,你还额外得到了每个碱基如何掺入的动力学信息。我们用PacBio对E.coli O104:H4菌株进行了“前所未有的全基因组甲基化谱分析”,共发现了50,000多个甲基化位点。

——Matthew Waldor(美国霍华德休斯医学研究所研究员)
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碱基修饰直接测序法的原理
        这就好比是开车经过减速带,一个凸起的路障会干扰车速。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式”产生微小差异,最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。

——Stephen Turner(美国PacBio公司创始人兼CTO)
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直接测序法分析甲基化组学(Methylome)的先行者
        通过与PacBio合作完成的全基因组甲基化谱分析,我们可以找到甲基化酶的识别序列,无论是什么甲基化酶,只要它在那。这真是我们首次有能力对细菌基因组进行全方位的甲基化组学分析。

——Richard Roberts(1993年诺贝尔生理学或医学奖得主,现为美国NEB公司CSO)
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化学标记富集法推动碱基修饰直接测序
        我们就是想把5-hmC的检测变得敏感些,最容易想到的是,加个标签以便富集信号。通过这个试剂盒,不光可以检测出羟甲基化修饰,还可以显著降低检测覆盖度。

——Chuan He(美国芝加哥大学生物物理动力学研究院总监)
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碱基修饰直接测序法适用软件和其他应用案例
        目前软件可以自动识别5-mC、4-mC、6-mA等碱基修饰,其它碱基修饰可参照相关文献通过设立对照进行检测。我们还将对软件不断进行升级,2013年陆续推出其他各种碱基修饰类型。

——Edwin Hauw(美国PacBio公司产品管理高级总监)
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      主题四: PacBio RS系统在靶向测序和临床诊断中的独到应用


SNP和Indel变异验证、广义单倍体型分析
        PacBio单分子测序技术能对基因组中的低频变异进行高效解读,且能够有效弥补Sequenom和Sanger方法的缺陷,可以寻找除已知位点以外的其他漏检稀有突变。

——Matthew Meyerson(美国Broad研究院高级成员)
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串联重复突变和低频突变检测
        我们一开始也不敢确定PacBio是否能应付,但实际使用下来,我们低估了PacBio,在单分子检测条件下,我们竟然能检测到最低至2.7%的突变。

——Neil Shah(美国加州大学旧金山分校医学院血液科副教授)
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三联核苷酸异常扩增分析
        我们证实了PacBio可以测超过750个CGG重复片段,并能够精确定位AGG突变。这种方法保障了单碱基分辨率,今后也能完整鉴定所有与疾病相关的等位基因,从而有利于准确及时的临床诊断。

——Paul Hagerman(美国加州大学戴维斯分校医学院生物化学和分子医学教授)
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mRNA可变剪切和病毒变异分型
        而单分子测序则不同,其生成的长片段能一次性完成通读,有助于在大范围内对可变剪切位点进行直接分析。此外PacBio的CCS测序模式能够提供准确度非常高的序列数据,使得转录组可变剪切位点分析更加准确。

——Frederic Bushman(美国宾夕法尼亚大学微生物系教授)
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临床快速诊断实施和无需建库方案
        由于周转时间的限制,PacBio RS系统快速测序能力也是我们选择它的一个主要原因。我们拥有PacBio快一年了,它确实用起来又快又方便。同时,PacBio的序列无偏好性测序的特点也是一个重要考虑因素。

——John McPherson(加拿大安大略癌症研究所基因组技术总监)
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      主题五:PacBio的未来方向以及为测序带来的变化?


PacBio系统的已有升级和表现效果
        通过最近的软件更新,PacBio RS系统可以产出超长读长并实现超高精度的从头组装,这极大地改善了我们的发现能力,以便更经济高效地获得新型基因组信息。

——J. Craig Venter(全球知名生物学家及企业家,时代杂志2007/2008年将他选进世界上最有影响力的人之一)
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PacBio系统的未来升级方向
        理想情况下,单分子边合成边测序反应完全可以做到大规模并行,DNA聚合酶的体外合成效率可以高达1毫秒/碱基。要克服光学技术壁垒,最有前途的方式是把生物现象转化为电信号来检测。

——Madoo Varma(美国Intel公司整合生物系统实验室负责人)
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总裁展望
        我们的客户已经抓住了PiaBio的价值精髓,并开始不惜投入了。正是这些客户将最终成为我们最好的销售向导,而PacBio的独特价值将逐渐引导客户进入下一轮订购潮。

——Michael Hunkapiller(美国PacBio公司主席兼CEO)
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PacBio亚洲代理和测序服务公司
        我们非常荣幸能成为PacBio公司在中国大陆和香港的独家经销商,也非常期待能把这一突破性的创新技术带入中国。PacBio RS系统正为我们展开全新的视角,我们同时盼望SMRT 技术能为中国测序界带来前所未有的悸动。

——Cheung To(中国香港Gene Company Limited创始人兼主席)
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近期相关会议推荐
        为全面总结疾病遗传学和基因组学研究进展,探讨后GWAS时代疾病发病机制研究的机遇与挑战,推动转化医学发展,兹定于2013年5月16-18日在上海举行第三届《自然遗传》疾病基因组学国际研讨会(Workshop)。论坛由《Nature Genetics》(《自然遗传》杂志)联合安徽医科大学,上海交通大学和复旦大学共同主办,Myles Axton博士与张学军教授共同任执行主席。论坛主题是“From GWAS to Precision Medicine”,主要围绕复杂疾病的发病调控表达研究,复杂疾病全基因组关联研究meta分析,复杂疾病表观遗传学研究,全基因组外显子测序搜寻疾病遗传变异及转化基因组学研究。
        论坛将邀请来自《自然遗传》、美国哈佛大学、美国华盛顿大学、美国科罗拉多大学、英国伦敦大学、英国邓迪大学、新加坡国立大学,中国医学科学院、上海交通大学、复旦大学、浙江大学、同济大学、中山大学、中南大学及第二军医大学等国内外相关单位权威学者参会。PacBio公司创始人兼首席科技官Stephen Turner先生受邀参会,将在会议期间分享PacBio RS系统特有的单分子实时测序(SMRT)技术在后GWAS时代的创新应用。
        报告题目:Extremely Real Long Reads Using SMRT Sequencing as a Follow Up to Post-GWAS Candidate Regions
        报告人:Stephen Turner, Founder & CTO at Pacific Biosciences
        会议网址:http://www.natureasia.com/en/events/gwas-2013/


1380 Willow Road, Menlo Park, CA 94025
650.521.8000
www.pacificbiosciences.com



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