PMA™ 染料

qPCR 法选择性的检测活细菌和死细菌，可广泛用于食品安全检测

PMA™ - 定量 PCR 基本操作步骤
添加 PMA™ 染料到样品中，并在黑暗中孵育
• 暴露在冷光下，使 PMA™ 染料交联到 DNA 上
• 裂解完整的细胞，提取 DNA
• 常规实时荧光定量 PCR

       PMA™ 高效选择和灵敏的检测死细菌中存在的活菌数在许多实际应用，包括安全检查，食品，饮用水的质量控制，医疗诊断等方面至关重要。传统使用细菌培养的检测方法，既费时又不灵敏。建立在实时荧光定量qPCR上的检测，是一个快速而高度敏感的替代方法。然而普通qPCR方法的分析结果并不能区分活死细胞。

       由 Biotium 开发的新型的DNA 修饰染料-- 叠氮溴化丙锭（PMA™）克服了该难题。用PMA 预处理的样本用于PCR 分析，为选择性的检测活细菌提供一个高度敏感和可靠的方式。PMA™ 是一种DNA 高亲和力的光反应染料，染料嵌入双链DNA 暴露在强烈的可见光下形成共价连接，形成化学修饰DNA，不能经PCR扩增(图1）。由于PMA™ 的设计是细胞膜不透性，检测包含活、死细菌的样本时，只有死细菌由于细胞膜损害，其DNA 敏感的被PMA™ 修饰。随后可以通过定量PCR 选择性的检测活细菌。

       PMA™-定量PCR 技术不仅应用于细菌，还可以用于其他类型的细胞。 biotium 还提供其他配套产品，包括优越的荧光定量饱和染料EvaGreen qPCR 和安全高度敏感的核酸凝胶染料GelRed™和 GelGreen™。

图1. PMA™是一种DNA 高亲和力的光反应染料，染料嵌入双链DNA暴露在强烈的可见光下形成共价连接，形成化学修饰DNA，不能经PCR 扩增。由于PMA™的设计是细胞膜不透性，检测包含活、死细菌的样本时，只有死细菌由于其细胞膜损害，其DNA 敏感的被PMA ™修饰。随后可以通过定量PCR 选择性的检测活细菌。

图2. 利用PMA-qPCR 检测活的及热灭活的大肠杆菌。（A）表示使用PMA 预处理的活、死大肠杆菌实时PCR 定量分析示意图，使用16SrRNA 一段引用。（B）用PMA 处理的活死菌样本与没用PMA 处理的活死菌样本的ΔCT。ΔCT 是用PMA 处理样品的CT 值减去没用PMA处理的相应样本的CT 值（即Ct with PMA–Ct without PMA）。这里活死大肠杆菌用或不用PMA 处理的都暴露在光线下孵育5 分钟。

实践应用：

PMA™ 高效选择和灵敏的检测死细菌中存在的活菌数实际应用包括： 
• 安全检查 
• 食品、饮用水的质量控制 
• 抗菌研究 
• 医疗诊断等

PMA™ Real-Time PCR 细菌活力检测试剂盒适用于: 
• 沙门氏菌
• 金黄色葡萄球菌
• 抗药性金黄色葡萄球菌
• 大肠杆菌
• 结核杆菌
• 李斯特菌

参考文献：
1) Kobayashi, et al. (2009) Improving clinical signif cance of PCR: use of propidium monoazide to distinguish viable from dead
Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. J Orthop Res 27:1243-1247.
2) Kobayashi, et al. (2010) Distinction between intact and antibioticinactivated bacteria by real-time PCR after treatment with propidium monoazide. J Orthop Res. In print.
3) Luo, et al. (2009) Method to detect only viable cells in microbial ecology. Appl Microbiol Biotechnol 86:377-384.
4) Nocker, et al. (2006) Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by
selective removal of DNA from dead cells. J Microbiol Methods 67:310-320.
5) Nocker, et al. (2007) Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl Environ Microbiol 73:5111-
5117